论文摘要
目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种较常见的锥体外系疾病,它以运动迟缓、肌强直、震颤和姿势异常为主要表现。PD的发病率随着年龄的增加而增加,严重影响患者生活质量,给家庭和社会带来了沉重的负担。目前,对于PD的治疗主要为药物及外科治疗,但二者均起不到神经保护及促进神经功能重塑的作用,因而都不是治疗PD的理想手段。近年,经颅磁刺激（Transcranial Magnetic Stimulation,TMS）技术成为国内外研究的热点,它是一种具有无痛、无损伤、操作简便、安全可靠等优点的生物学技术。临床报道首见于1985年,在20年的发展中,TMS的临床应用研究一直集中在精神心理疾病和神经退行性疾病。TMS是在强大电磁场作用下,在脑深部产生感应生物电流,从而影响相应脑神经细胞电活动和局部功能的一种无创的物理方法。通过调节频率、强度、刺激间歇和刺激时间对中枢神经系统的功能产生不同的影响,因而对中枢及外周神经系统疾病具有治疗作用。实验室前期工作证实:TMS能够增加MPTP诱导的PD小鼠纹状体GAP-43和SYN的表达[1],提示TMS有促进神经再生和突触重塑作用;利用低频MS对对数生长期的PC12细胞进行干预,发现细胞突起生长明显增多和DA含量增加[2]。本研究旨在通过磁刺激（Magnetic Stimulation,MS）作用于原代培养的神经元明确MS对原代神经元突起生长及形态的影响,并初步探讨了磁刺激对细胞的生长发育的影响机制。方法:常规方法提取出生1天的昆明小鼠海马及中脑原代神经元。将海马及中脑神经元接种于直径为35mm培养皿中,培养液为含10%胎牛血清的DMEM,24h后更换培养液为Neurobasal+2%B27,培养72h后再次换液,共培养6天。实验共分为4组:1.正常组（control,C）:在37℃CO2孵育箱中正常培养。2.假刺激组（shame,S）:暴露于磁场环境,但不接受磁刺激。3. 40%最大刺激强度组（40% of maximum intensity of stimulation,M1）:利用40%的磁场最大刺激强度（约0.76T）作用于细胞。4. 60%最大刺激强度组（60% of maximum intensity of stimulation,M2）:利用60%的磁场最大刺激强度（约1.14T）作用于细胞。每天于固定时间刺激细胞。每天刺激三组,每组20序列,每个序列间隔1s,每组间隔1min,连续刺激5 d。刺激频率为1 Hz,磁刺激仪的最大刺激强度为1.9 T。刺激5天后利用MAP-2及Hoechst33258进行细胞免疫化学染色并在荧光显微镜下观察细胞突起的生长状态,并且通过细胞计数确定多突起神经元占神经元总数的百分率,利用RT-RCR检测生长相关蛋白-43（Growth-associated protein-43,GAP-43）及突触蛋白（Synapsin I,SYN-I）mRNA的表达。结果采用SPSS13.0统计软件处理,所有计量资料采用x±S表示,各组之间采用单因素方差分析进行显著性分析。结果:1磁刺激对原代神经元突起形态的影响:1.1磁刺激对海马原代神经元的影响:MS 24h后可见细胞均匀分布在培养皿上,小部分细胞可见短小突起,各组之间无明显差别。MS 48h后观察可见细胞生长良好,并且大部分细胞可见小突起生长,各组无明显差别。MS 72h后观察见细胞生长状态良好,与C和S组比较,M1、M2组细胞突起较长,细胞与细胞间联系较多,部分细胞表现为多突起生长。MS 96h后观察各组间突起与突起间联系均显增多,部分细胞间形成明显的网状连接。MS 120h后观察细胞与细胞间网状连接更加明显,镜下已不能明确观察各组间差别。1.2磁刺激对中脑原代神经元的影响:MS 24h后观察可见细胞均匀分布在培养皿上,尚不能清晰分辨细胞的突起,各组之间无明显差别。MS 48h后观察细胞生长良好,并可见部分细胞有小突起生长,各组间无明显差别。MS 72h后观察细胞生长状态良好,与C和S组相比,M1、M2组细胞突起较长,小部分细胞表现为多突起生长。MS 96h后观察细胞突起与突起间的联系增多,M1、M2组小部分细胞与细胞突起间形成网状连接。MS 120h后观察各组均可见细胞与细胞间形成网状连接,镜下不能明确观察各组间差别。2各组细胞突起计数以及统计学结果:2.1海马原代神经元各组突起数计数:2个突起的神经元占总神经元的比例发现:M1、M2组细胞突起比例数（M1组:45.61%±14.92%;M2组:45.18%±15.64%）多于C、S组（C组:33.42%±9.49%;S组:34.09%±8.44%）,结果有统计学差异（P<0.05）;3个及3个以上突起的神经元占总神经元的比例发现:M1、M2组细胞突起比例数明显多于C组和S组（P<0.01）（C组:22.81%±10.36%;S组:24.05%±9.12%,M1组:30.25%±10.80%;M2组:29.32%±11.49%）,结果有统计学差异。2.2中脑原代神经元各组突起数计数:2个突起的神经元占总神经元的比例发现:M1、M2组细胞突起比例数（M1组:29.76%±11.85%;M2组:32.45%±12.65%）明显多于C、S组（C组:20.19%±13.92%;S组:23.02%±10.90%）,结果有统计学差异（P<0.01）;M1、M2两组间比较无明显差异（P>0.05）。3个及3个以上突起的神经元占总神经元的比例发现:M1、M2组细胞突起比例数明显多于C组和S组（P<0.01）,且M2组突起数多于M1组（P<0.05）（M1组:18.53%±13.69%;M2组:23.53%±12.56 %;C组:13.10%±8.14%;S组:11.95%±8.32%）。2.3中脑原代神经元各组细胞突起长度测量计数:本实验发现M1、M2两组细胞突起长度较C、S组明显增长,结果有明显统计学差异（P<0.01）。3 SYN-I和GAP-43检测:3.1海马原代神经元SYN-I mRNA的表达: M2组的SYN-I mRNA的表达与C、S两组比较有统计学差异（p<0.05）;而M1组SYN-I mRNA的表达虽然与各组间表达有一定的不同,但在统计学上无明显差异（P>0.05）。3.2中脑原代神经元SYN-I mRNA的表达:M2组的SYN-I mRNA的表达与C组、S组、M1组比较均有统计学差异（P<0.05）;而M1组SYN-I mRNA的表达虽比C、S两组多,但在统计学上无明显差异（P>0.05）。3.3海马和中脑原代神经元GAP-43 mRNA的表达:本实验中海马及中脑原代神经元各组间GAP-43 mRNA的表达均无明显统计学差异（P>0.05）。结论:本研究以强度为0.76T和1.14T,频率为1Hz的磁场作用于原代培养的海马及中脑原代神经元,并用免疫荧光染色方法和RT-PCR检测技术检测原代神经元SYN-I mRNA和GAP-43 mRNA的表达,初步探讨了MS促细胞分化的作用机制。研究证实:1.场强为0.76T和1.14T、频率为1Hz的脉冲磁场有促进原代神经元突起生长的作用:表现为本实验参数下的磁刺激可促进海马和中脑原代神经元突起个数的增加,并通过观察中脑原代神经元发现有促进突起长度生长的作用。2.SYN-I可能在这一促进作用中发挥一定的效应。