论文摘要
研究目的：鱼藤素（deguelin）是从豆科毛鱼藤植物中分离的一种黄酮类化合物,可抑制肺癌、胃癌、乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,体外实验表明鱼藤素可以抑制PI3K活性,降低pAkt磷酸化水平,下调环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）的蛋白表达,但是有关鱼藤素在体内的作用机制尚不清楚。本实验室利用模式生物斑马鱼胚胎研究鱼藤素初步发现：0.6μM浓度鱼藤素处理2细胞期胚胎,可以使胚胎在受精后4小时（4 hpf,4 hours post fertilization,又称sphere时期）停止发育,不能进行原肠胚运动,该表型与干扰斑马鱼胚胎COX/PGE2信号通路或PI3K/Akt信号通路的表型相似,推断鱼藤素可能抑制了斑马鱼胚胎的COX/PGE2信号通路,进而影响了下游PI3K/Akt信号通路,具体机制还有待探究。本课题希望利用荧光定量PCR,整胚原位杂交生物技术来检测斑马鱼上COX/PGE2信号通路和其下游相关基因的变化,而后选取与COX信号通路密切相关的肿瘤细胞,检测鱼藤素对其增殖的抑制作用,利用荧光定量PCR法检测这些肿瘤细胞中COX信号通路相关基因的变化,以验证鱼藤素的抗肿瘤作用与抑制COX信号通路相关性,为预测鱼藤素在体内抗肿瘤的作用机理提供基础依据。研究结果：（1）利用荧光定量PCR检测0.6μM鱼藤素作用前后的sphere期胚胎COX/PGE2通路相关基因,发现coxl, cox2b在转录水平并未发生明显变化,PGE2合成酶ptges、ptges3a的mRNA的表达下降水平与空白对照组相比有统计学差别（p<0.05）,PGE2的受体ep2,ep4均发生显著下降,下游基因egrl和cyclin D1基因表达均发生了显著下调（p<0.01）。（2）0.16μM鱼藤素处理6 hpf时期胚胎至21体节期,用原位杂交的方法研究scl和gatal表达变化,发现在10体节期和21体节期,鱼藤素均抑制了scl和gatal的表达。5μM dmPGE2、0.16μM鱼藤素、5μM dmPGE2和0.16μM鱼藤素混合物处理10体节时期胚胎至30 hpf,用原位杂交的方法研究runxl表达,发现在30 hpf时期,与空白对照组相比,5μM dmPGE2提高了runxl表达,HSCs的数量明显增多,0.16μM鱼藤素抑制了runxl的表达,而用5μM dmPGE2和0.16μM鱼藤素混合物处理,与dmPGE2单独处理相比,runxl表达明显下降。（3）利用荧光定量PCR检测了21体节期胚胎COX/PGE2信号相关基因,另外scl, gatal, runxl, cmyb基因在这一时期对血细胞系前体均有特异性表达,对这四个标记性基因也进行了相对定量分析,其结果发现：coxl, ptges3a, ep4a, ep4b, egrl, cyclinDl, scl, gatal, runxl, cmyb基因均发生了显著下降（p<0.01）, cox2b, ptges基因表达下降水平与空白对照组相比有统计学差别（p<0.05）。另外,利用荧光定量PCR法检测了30 hpf时期COX/PGE2信号通路相关基因,研究发现在30 hpf这一时期,COX/PGE2信号通路上cox2b基因发生了显著下降,其下游基因egrl也发生了显著下降（p<0.01）, ep4b受体基因表达下降水平与空白对照组相比有统计学差别（p<0.05）。（4）鱼藤素作用于MCF-7, Mia PaCa-2, PC-3细胞48小时后,均可以抑制其细胞增殖,随着浓度的增加,抑制效果越为明显。荧光定量PCR检测鱼藤素作用48小时后这三个细胞的COX/PGE2信号通路相关基因,发现鱼藤素处理后,MCF-7细胞中COX1和EP2基因的表达发生了明显下降（p<0.01）; Mia PaCa-2细胞中PTGES基因的表达水平发生了显著降低（p<0.01）, EP4和CCND1基因的表达下降水平与空白对照组相比有统计学差别（p<0.05）; PC-3细胞中COX1基因的表达水平发生了显著下降（p<0.01）。结论：（1）鱼藤素可以抑制斑马鱼胚胎体内COX/PGE2信号通路相关基因的表达。（2）鱼藤素可以抑制MCF-7, Mia PaCa-2, PC-3细胞增殖。（3）鱼藤素可以抑制MCF-7, Mia PaCa-2, PC-3细胞中COX/PGE2信号通路的相关基因的表达。