肺癌相关新基因DENND2D和OLC1的功能研究

论文摘要

世界范围内肺癌发病率和病死率居各恶性肿瘤首位,严重危害人们健康,目前临床上缺乏有效的诊疗措施,肺癌患者的五年生存率不足15%。鉴定和研究相关癌基因和抑癌基因的功能有望为肺癌防治提供新的靶标,因而一直是肺癌研究领域内的热点。我们实验室的前期工作从中国人肺鳞癌差异表达cDNA文库中发现、克隆并初步鉴定得到两条新基因,一为候选抑癌基因DENND2D,一为候选癌基因OLC1。本课题主要围绕候选抑癌基因DENND2D展开深入研究,探讨其功能、作用机制和可能的应用前景。为明确DENND2D基因在生理状态和肿瘤中的差异表达谱信息,我们首先利用Northern blot方法在肺、睾丸和胎盘组织中检测到了与预测大小一致的该基因天然转录本,而在心脏、脑和肌肉组织中则未检出DENND2D的表达;利用Real Time PCR方法我们在16例肺鳞癌患者的肿瘤与正常配对组织中检测了DENND2D的差异表达情况,以2倍差异作为接受标准,发现它在50%的肿瘤组织中低表达。为深入研究基因功能,我们首先建立了DENND2D的四环素诱导表达腺病毒系统,实现了基因的可控表达。针对在人肺癌细胞系H1299的研究发现,DENND2D的诱导表达可以直接引发细胞凋亡,并且凋亡发生率呈时间一剂量依赖性上升。进一步研究发现诱导表达DENND2D后,H1299细胞线粒体膜电位下降,Caspase 9和Caspase 3的蛋白水平活性增高,应用广谱Caspase抑制剂和针对Caspase 9的抑制剂后,DENND2D的凋亡诱导作用明显下调,初步证实了DENND2D可以直接诱导Caspase依赖的线粒体途径凋亡。我们利用融合标签蛋白示踪了DENND2D的蛋白定位提示为DENND2D定位于胞浆。同时我们在蛋白水平证明了DENND2D虽然激活JNK通路,但是DENND2D的凋亡诱导作用并非JNK依赖,应用JNK显性负突变体和特异JNK抑制剂SP600125均未对DENND2D的凋亡诱导作用产生影响。在肺鳞癌细胞系H520和肺腺癌细胞系A549中的研究结果提示,DENND2D的凋亡诱导作用不受DENND2D本底表达情况的影响。最后,我们采用裸鼠移植瘤模型从体内水平证实了DENND2D的抑瘤活性并利用Tunel方法原位检测瘤内凋亡情况,发现DENND2D肿瘤抑制作用可能也是通过诱导细胞凋亡实现。针对候选癌基因OLC1,为进行后续上皮细胞转化实验,我们构建了OLC1的诱导表达腺病毒系统。为了实现外周血血浆中OLC1蛋白的检测分析,我们与中国医学科学院基础医学研究所陈实平教授课题组合作,已经制备并鉴定了10株OLC1蛋白的单克隆抗体。为明确OLC1基因的生理学和病理学功能,我们与中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组合作,分别制备得到了全身广泛表达和肺组织特异表达OLC1的转基因小鼠:组织学研究发现二者都有明显的Ⅱ型肺泡上皮细胞增生,提示了OLC1的生理学功能线索。目前OLC1相关实验仍在进行之中。同时作为附加研究内容,我们还对来自肺癌差异表达cDNA文库的候选癌基因RAP2B的功能作了初步探讨。研究发现RAP2B在约67%（18/27）肺鳞癌肿瘤组织中高表达,在体外具有恶性转化Rat1细胞能力,并且可能通过激活NF-kappaB信号通路在肺癌发生发展中发挥作用。

论文目录

• 目录
• 图表目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 材料和方法
• 实验材料
• 1 主要表达载体
• 2 菌株
• 3 主要工具酶及试剂盒
• 4 主要抗体
• 5 所用引物
• 实验方法
• 1.1 组织样品来源
• 1.2 细胞系及培养条件
• 1.3 基因克隆
• 1.4 RNA提取及cDNA文库构建
• 1.5 组织DNA的提取制备
• 1.6 Real Time PCR分析
• 1.7 重组腺病毒的构建包装
• 1.8 细胞的质粒转染和腺病毒感染
• 1.9 细胞生长曲线绘制
• 1.10 细胞集落形成实验
• 1.11 细胞凋亡检测方法
• 1.12 线粒体膜电位变化的检测
• 1.13 细胞荧光观察蛋白定位
• 1.14 MAPK通路报告基因实验
• 1.15 Northern blot
• 1.16 Western blot
• 1.17 裸鼠动物实验
• 1.18 原核蛋白的表达纯化
• 1.19 转基因操作（实验由医科院动物所宋铭晶老师完成）
• 1.20 免疫组织化学染色
• 1.21 常用生物信息网站
• 1.22 统计学处理
• 实验结果与讨论
• 第一部分 DENND2D的功能研究
• 1 DENND2D的表达谱分析结果
• 1.1 DENND2D正常组织表达谱
• 1.2 DENND2D在肺鳞癌配对组织中的表达谱
• 1.3 DENND2D的电子表达谱
• 2 DENND2D的凋亡诱导作用
• 2.1 Ad-TRET-DENND2D重组腺病毒包装和鉴定
• 2.2 DENND2D在H1299细胞中的诱导凋亡表型
• 2.3 DENND2D在多种肺癌细胞系中的凋亡诱导作用
• 2.4 DENND2D凋亡诱导机制探讨
• 3 DENND2D的蛋白定位和对MAPK通路的影响
• 3.1 DENND2D的蛋白定位
• 3.2 DENND2D对MAPK通路的影响
• 4 DENND2D的体内抑瘤作用
• 4.1 DENND2D ex-vivo水平的抑瘤作用
• 4.2 DENND2D的in-vivo水平抑瘤作用
• 4.3 Ad-DENND2D的生物安全性评价
• 5 关于DENND2D功能研究的讨论
• 5.1 关于DENND2D表达谱
• 5.2 关于DENND2D的凋亡诱导作用
• 5.3 关于DENND2D的定位和对MAPK通路的影响
• 5.4 关于DENND2D的体内作用
• 6 关于DENND2D研究内容小结
• 第二部分 OLC1基因的功能研究
• 1 OLC1的四环素诱导表达腺病毒系统构建
• 1.1 pShttle-TRET-OLC1穿梭载体构建
• 1.2 pAd-TRET-OLC1重组腺病毒载体构建和鉴定
• 1.3 Ad-TRET-OLC1重组腺病毒的包装扩增和滴度测定
• 1.4 Ad-TRET-OLC1重组腺病毒的验证
• 2 OLC1单抗的制备和验证
• 2.1 OLC1原核蛋白的表达纯化
• 2.2 单克隆抗体的制备、纯化以及特异性鉴定
• 3 OLC1转基因小鼠的制备
• 3.1 注射用DNA的制备（广谱表达和肺组织特异表达）
• 3.2 转基因过程
• 3.3 转基因阳性鼠的鉴定
• 3.4 转基因鼠的生物观察
• 3.5 转基因鼠肺组织结构观察
• 4 关于OLC1研究的讨论
• 5 OLC1研究内容总结
• 附加研究内容
• 新的肺癌候选癌基因RAP2B的鉴定和功能研究初探
• 文献综述
• 肺癌的研究进展
• MicroRNA与肿瘤
• 附录
• 1 英文缩略词
• 2 主要仪器设备及耗材
• 3 常用载体图谱
• 参考文献
• 致谢
• 基金资助
• 个人简历