雷公藤甲素和甲氨喋呤对免疫性心肌炎大鼠左心室重构影响的实验研究

论文摘要

背景心肌炎（myocarditis）和扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）是年轻患者发生心力衰竭（heart failure,HF）,心律失常及猝死的首要原因。由于心肌炎和DCM发病机理的复杂性,勿庸置疑地造成了治疗上的困难。目前,越来越多的证据表明自身免疫机制及随后的左室重构在心肌炎和DCM发病中扮演重要角色;心肌炎和DCM可能分别代表了心肌器官特异性自身免疫性疾病的急性和慢性阶段。很多学者采用心肌特异性自身抗原肌球蛋白免疫大鼠或小鼠成功建立了实验性自身免疫性心肌炎（ experimental autoimmune myocarditis,EAM）模型,该炎症反应慢性迁延可导致心脏出现DCM样改变甚至发生HF,通过此模型来研究心肌炎和DCM的非特异性免疫调节治疗也显示了良好的前景。目的研究雷公藤甲素（Triptolide,TP）和甲氨喋呤（methotrexate,MTX）对EAM模型大鼠左心室重构和心功能的影响,以及对外周血清中炎症细胞因子的调节作用和其可能的作用机制。方法采用猪心肌球蛋白免疫大鼠的方法制备EAM模型,同时设正常对照组（Control组,用生理盐水进行假性免疫）。观察大鼠体重变化以及足部溃疡的形成,ELISA法检测血清中抗肌球蛋白抗体的浓度。在建立EAM模型后,随机分为五组,分别用雷公藤甲素低剂量(TP-L,5μg·kg-1·d-1),雷公藤甲素高剂量(TP-H,10μg·kg-1·d-1),甲氨喋呤低剂量(MTX-L,0.3 mg·kg-1每周二次),甲氨喋呤高剂量(MTX-H,0.6 mg·kg-1每周二次)和生理盐水（1 mL）对EAM大鼠进行腹腔注射干预,而Control组用生理盐水进行干预。42天后采用超声心动图评估心脏结构和功能,测定左室质量指数（left ventricular mass index,LVMI）,HE染色观察光镜下左心室心肌组织结构变化,Masson特殊染色测量左心室心肌胶原容积分数和心肌血管周围胶原面积,免疫组织化学染色法检测左心室Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量及其比值,ELISA法检测外周血清中炎症细胞因子的浓度,ELISA法检测心肌组织中NF-κB的活性。结果1.EAM组大鼠模型的评估:①EAM组体重增长明显慢于Control组,从实验第1周起足部开始出现溃疡,至第4周所有大鼠均出现溃疡,部分还出现踝关节肿胀。②血清抗肌球蛋白抗体检测均为阳性,而Control组无一例出现足部溃疡,血清抗体均为阴性。③70天超声检查:与Control组相比,EAM组左室舒张末期内径扩大（P<0.01）,左室射血分数、缩短分数明显下降（P<0.01,P<0.05）。④EAM组LVMI较Control组明显增高,有统计学意义（P<0.01）。⑤HE染色:Control组心肌排列整齐,EAM组心肌细胞变性、肥大、坏死,心肌间质中胶原纤维弥漫性增生,排列紊乱伴少量淋巴细胞浸润。⑥Masson染色:Control组肌束间和小血管周围有少量染成绿色的胶原纤维,EAM组肌束间和小血管周围胶原纤维呈片状增生,心肌胶原容积分数与心肌血管周围胶原面积比Control组均明显增加（P<0.01）。⑦免疫组织化学显示:EAM组与Control组相比,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量均明显增加（P<0.01）,Ⅰ/Ⅲ胶原比例明显升高（P<0.01）。2. TP和MTX对左心室重构和心功能的影响:①与EAM组相比,TP-L,TP-H和MTX-L,MTX-H治疗组左室舒张末期内径均减小（P<0.01）;左室射血分数均均增加（P<0.01）。②TP-L,TP-H和MTX-L,MTX-H治疗组的LVMI较EAM均降低（P<0.01）。③HE染色:四治疗组病理组织学变化介于Control组和EAM组之间。④Masson染色:四治疗组胶原纤维增生程度较模型组明显减轻,心肌胶原容积分数（P<0.01）和心肌血管周围胶原面积均下降（P<0.05）,不同浓度药物组之间无明显差异。⑤免疫组织化学染色显示:与EAM组相比,MTX两组Ⅰ型胶原均明显减少（P<0.01）,Ⅲ型胶原均轻度下降（P>0.05）,Ⅰ/Ⅲ比值均明显下降（P<0.01）,两组间无统计学差异;TP两组Ⅰ型胶原含量均明显减少（P<0.01）,但Ⅲ型胶原含量均增加（P<0.05）,Ⅰ/Ⅲ比值明显均下降（P<0.01）,TP两组间亦无统计学差异。3. TP和MTX对外周血清中炎症细胞因子浓度的影响:①EAM组血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）,白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）,单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）和白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）的浓度较Control组明显增加（TNF-α: P<0.01;IL-1:P<0.01;MCP-1:P<0.05;IL-6: P<0.01）。②TP-L,TP-H,MTX-L,MTX-H组较显著EAM组下降（TNF-α: P<0.05;IL-1:P<0.05;MCP-1:P<0.01;IL-6: P<0.05）。③EAM组血清中白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）的浓度较Control组增高（P>0.05）,MTX-L,MTX-H治疗组较EAM组有增加趋势,但（P>0.05）,TP-L和TP-H治疗组有下降趋势,但均无统计学差异（P>0.05）。4. TP和MTX对心肌组织NF-κB活性的影响:EAM组心肌组织中被激活的NF-κB活性较Control组增加（P<0.01）,MTX-L,MTX-H,TP-L和TP-H治疗组均较EAM组降低（P<0.05）;EAM组心肌组织中磷酸化的NF-κB活性较Control组增加（P<0.01）,MTX-L,MTX-H,TP-L和TP-H治疗组均较EAM组明显降低（P<0.01）。结论①应用猪心肌球蛋白免疫大鼠可成功建立EAM大鼠左心室重构模型。②TP和MTX可以减轻EAM大鼠心肌纤维化程度,延缓左心室重构进程,轻度改善心功能;同时可以非特异性免疫调节大鼠外周血清中炎症细胞因子;其中机制可能部分与抑制NF-κB激活途径有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语表
• 前言
• 前言参考文献
• 材料与方法
• 1 实验动物
• 2 主要药品、试剂及公司
• 3 主要实验器材及公司
• 4 方法
• 5 统计学处理
• 结果
• 1 一般情况
• 2 心脏结构和功能
• 3 外周血清中细胞因子浓度变化
• 4 心脏标本肉眼观
• 5 左心室重构质量指数的评价
• 6 HE 染色
• 7 Masson 染色心肌胶原纤维
• 8 免疫组化法染色胶原纤维
• 9 各组心肌组织 NF-κB 活性的变化
• 讨论
• 1 心肌炎和扩张型心肌病
• 2 心肌炎向 DCM 转化的发病机制
• 3 心肌炎的模型
• 4 心肌炎的治疗
• 5 TP和MTX治疗EAM的理论基础
• 6 MTX 和 TP 治疗 EAM 的可能机制
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文