论文题目: 猪瘟和猪水泡病基因标记疫苗的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 冯霞
导师: 谢庆阁,刘湘涛
关键词: 基因,基因,基因疫苗,标记疫苗,细胞因子,报告草因
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 猪瘟和猪水泡病被世界动物卫生组织(OIE)列入A类传染病名录,世界各国对这两种疫病均采取了严加防制及消灭措施,二者也是国际贸易中必查必检的对象。疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。由于传统疫苗在生产中的生物安全隐患和感染与免疫动物难以鉴别等缺陷,利用现代分子生物学技术和免疫学理论,研制新型安全、多联、可鉴别疫苗已成必然之势。基因疫苗以其自身的诸多优点和巨大的应用潜能已成为当今的研究热点之一。本研究通过RT-PCR、套式PCR和亚克隆技术构建了猪水泡病基因疫苗、猪水泡病和猪瘟二联基因疫苗和几种猪瘟基因疫苗,研究其免疫效果,为最终研制成功猪瘟和猪水泡病基因疫苗作技术探索。 1)构建了几种猪瘟基因疫苗:包括E2基因单表达重组质粒pcDNA Es1-11、E2基因双抗原表达质粒pBudCE Es1-11/Es2-22、E2基因与报告基因lacZ共表达质粒pBudCE lacZ/Es2-22、E2基因与猪IFN-γ基因共表达质粒pBudCE Es1-11/IFN-γ、以及E2基因与猪IL-18基因共表达质粒pBudCE Es1-11/IL-18,将以上真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,用原位染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)或RT-PCR技术证实它们均可表达外源基因。 2)用这几种猪瘟基因疫苗免疫兔,以阻断ELISA和MTT法监测试验兔抗体水平和淋巴细胞增殖情况,并进行攻毒保护试验。结果,单表达质粒pcDNA Es1-11免疫组中有3/4兔产生E2抗体,攻毒后,4/4完全保护。双抗原表达质粒pBudCE Es1-11/Es2-22免疫组有1/4兔产生抗体,攻毒后,1/4完全保护,1/4部分保护,2/4不保护。pBudCE Es1-11/IL-18利pBudCE Es1-11/IFN-γ免疫组,都未检测到猪瘟抗体(4/4),攻毒后,1/4部分保护,3/4不保护。pBudCE lacZ/Es2-22免疫组(3只)也没出现猪瘟抗体,攻毒后,3/3部分保护。而空载体pcDNA3.1和pBudCE4.1对照组,4/4血清阴性,攻毒后,全部发病。与对照组相比,各免疫组的淋巴细胞均有一定程度的增殖。 3)构建了猪水泡病和猪瘟二联基因疫苗pBudCE E2/P1-11,用它转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光染色和ELISA分别检测到猪水泡病和猪瘟抗原的表达。将其免疫兔,可检测到免疫组兔T淋巴细胞增殖明显;但用阻断ELISA未检测到血消CSFV特异性抗体,用猪瘟活疫苗(Ⅱ)攻击,实验兔有1/4完全保护。用乳鼠中和试验检测,发现所有兔血清SVDV中和抗体均低于1∶4。 4)构建了猪水泡病基因疫苗pcDNA P1,将其转染的BHK-21细胞经荧光染色,可见许多特异性荧光细胞。用其单独(B组)免疫或与pcDNA IFN-γ共同(C组)免疫猪三次,检测免疫前、后猪血清中SVDV特异性抗体的变化,发现免疫后B组和C组各有两只猪产生低水平的抗体,并在攻毒后迅速升高;并对免疫前和攻毒前的猪血清用乳鼠中和试验检测SVDV特异性抗体,结果只有pcDNA P1与pcDNA IFN-γ共同免疫组中有两只猪产生低水平的中和抗体(1∶4),其余猪的中和抗体均小于1∶4。第三次免疫3月后,用猪水泡病香港乳鼠组织毒5mL(2mL蹄叉和3mL颈部肌肉)分两个滴度(10~4 LD50/0.1mL和10~5 LD50/0.1mL)攻击,结果pcDNA P1单独免疫组(B组)有1/4获得完全保护(为10~4/0.1mL攻击),pcDNA P1与pcDNA IFN-γ共同免疫组(C组)中有1/4获得部分保护(为10~5/0.1mL攻击),A和D两个对照组全部发病。
论文目录:
第一章 序言
1.1 研究背景及目的、意义
1.1.1 猪瘟、猪瘟病毒和猪瘟弱毒疫苗
1.1.2 猪水泡病和猪水泡病病毒
1.1.3 基因标记疫苗
1.1.4 本研究的目的及意义
1.2 国内外研究现状
1.2.1 猪瘟疫苗研究进展
1.2.2 猪水泡病疫苗研究概况
1.3 研究内容与方法
第二章 猪瘟基因标记疫苗的构建及体外表达
2.1 材料和方法
2.1.1 菌种、载体和主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.1.3 细胞和种毒
2.1.4 引物的设计与合成
2.1.5 目的片段的获得
2.1.6 重组质粒的构建、克隆及鉴定
2.1.7 转染质粒的提取
2.1.8 转染
2.1.9 各基因体外表达的检测
2.2 结果
2.2.1 目的片段
2.2.2 表达质粒的鉴定
2.2.3 转染质粒浓度
2.2.4 各基因的体外表达
2.3 讨论
第三章 猪瘟基因标记疫苗对兔的免疫保护试验
3.1 材料与方法
3.1.1 质粒、疫苗与实验动物
3.1.2 主要试剂
3.1.3 免疫用质粒的制备
3.1.4 各猪瘟基因疫苗对家兔的免疫
3.1.5 阻断ELISA检测CSFV特异性抗体
3.1.6 T淋巴细胞增殖试验
3.1.7 病毒攻击保护试验
3.2 结果
3.2.1 兔血清CSFV特异性抗体的动态变化
3.2.2 T淋巴细胞增殖试验
3.2.3 攻毒试验
3.3 讨论
第四章 猪瘟与猪水泡病二联基因疫苗研究
4.1 材料和方法
4.1.1 菌种、载体和主要试剂
4.1.2 细胞、种毒、质粒、疫苗和实验动物
4.1.3 猪瘟病毒E2基因与猪水泡病病毒P1区基因双表达质粒的构建
4.1.4 转染质粒的提取、转染和体外表达
4.1.5 免疫用质粒的制备
4.1.6 双表达基因疫苗对家兔的免疫
4.1.7 阻断ELISA检测CSFV特异性抗体
4.1.8 T淋巴细胞增殖试验和猪瘟活疫苗(Ⅱ)攻毒保护实验
4.1.9 乳鼠中和试验
4.2 结果
4.2.1 猪瘟病毒E2基因与猪水泡病病毒P1区基因双表达质粒的鉴定
4.2.2 转染质粒浓度
4.2.3 间接免疫荧光染色检测猪水泡病抗原的表达
4.2.4 猪瘟E2蛋白的表达
4.2.5 双表达质粒免疫家兔的CSFV特异性抗体的动态变化
4.2.6 T淋巴细胞增殖试验
4.2.7 乳鼠中和试验
4.2.8 猪瘟活疫苗(Ⅱ)攻毒保护试验
4.3 讨论
第五章 猪水泡病基因标记疫苗的研究
5.1 材料和方法
5.1.1 材料
5.1.2 引物的设计和合成
5.1.3 猪水泡病基因疫苗的构建及体外表达
5.1.4 猪水泡病基因疫苗的猪体试验
5.2 结果
5.2.1 目的片段的获得和猪水泡病P1基因重组质粒的鉴定
5.2.2 转染质粒浓度
5.2.3 间接免疫荧光染色检测猪水泡病抗原的表达
5.2.4 间接ELISA检测SVDV特异性抗体
5.2.5 乳鼠中和试验检测猪血清SVDV中和抗体
5.2.6 攻毒保护试验
5.3 讨论
第六章 结论
第七章 猪水泡病及猪水泡病病毒研究进展(文献综述)
7.1 猪水泡病
7.1.1 疾病的发现、命名与流行情况
7.1.2 病原学
7.1.3 流行病学
7.1.4 临床症状和组织嗜性
7.1.5 诊断
7.2 猪水泡病病毒
7.2.1 SVDV基因组结构
7.2.2 SVDV编码的蛋白及功能
7.2.3 SVDV的衣壳结构和抗原特性
7.2.4 SVDV受体及其侵入
参考文献
致谢
附录
作者简历
发布时间: 2006-08-26
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