油菜种子特异表达启动子pFAE1和pNapB的结构与功能比较研究

论文摘要

随着生物技术的发展,植物种子不但是传统农产品的载体,还是高价值化学品和医药产品的载体。通过基因工程定向改变植物种子成分成为本世纪农业科技创新的重要组成部分。植物种子特异表达启动子是植物种子基因调控不可缺少的基因元件。启动子的组织特异性、作用强弱和时空表达特点是对基因进行精确调控的关键。本研究的目的是从油菜中克隆种子特异表达启动子pNapB和pFAE1,对他们的序列结构、作用强度和时空表达特点进行比较研究。通过同源序列法从油菜品种中油821中分离得到油菜种子储藏蛋白基因NapB和油菜脂肪酸延长酶基因FAE1的上游启动子序列pNapB和pFAE1,其中pNapB长1136 bp,pFAE1长1420 bp。生物信息学分析表明,两种启动子的核苷酸序列都含有种子特异表达启动子的顺式作用元件,包括RY重复、G-box和E-box等,但两种启动子顺式作用元件的序列分布不同。NapB启动子序列分析发现具有ABA应答元件中的distB和proxB,也被称为B-boxABA应答复合物以及GCN4模序,而FAE1启动子序列分析没有发现典型的B-box ABA应答复合物和GCN4模序。将pNapB和pFAE1两个启动子分别与报告基因GUS融合并通过农杆菌介导法导入烟草,得到大量转基因烟草植株。组织化学分析表明,两种启动子基本上是种子特异性表达的,但是都有渗漏表达,并且它们在种子中作用的时间和空间分布以及作用强度明显不同。pNapB启动子比pFAE1作用开始的时间早,持续时间长,在早期作用比pFAE1强,但pFAE1启动子在种子发育中期启动速度快,成熟种子的GUS染色深度在两种启动子间差别不大。荧光定量PCR分析表明,pNapB-GUS mRNA在开花后12天开始表达,而pFAE1-GUS mRNA的表达开始较晚。pNapB-GUS mRNA的最高表达量是pFAE1-GUS mRNA的20倍。将pNapB和pFAE1两个启动子分别与报告基因GUS融合并通过农杆菌介导法导入油菜中,只得到了pFAE1启动子的转化植株。对T1代转基因油菜进行组织化学分析结果表明,除了油菜种子外,在叶片和根部也能微弱的染上蓝色,说明本研究中pFAE1启动子的种子特异性不是很强。转pFAE1-GUS基因的油菜在开花后25天时种子的珠柄处开始染上蓝色,随着种子的成熟,胚珠被染上蓝色并逐渐加深,但是种皮不能染上颜色。利用RT-PCR技术对不同发育时期油菜种子中的内源FAE1和NapB基因表达模式进行分析,结果表明,NapB mRNA的积累是从开花后的25天开始的,要早于FAE1 mRNA。随着种子的成熟,NapB mRNA的表达逐渐升高,呈线性增长;FAE1mRNA从开花后30天开始积累,表达高峰期出现在开花后35天。随着种子的成熟,FAE1mRNA逐渐下降,呈钟型变化。本研究在启动子的序列特征、组织特异性、作用强弱和时空表达特点方面比较了FAE1和NapB两种种子特异表达启动子的异同,为两种启动子在种子基因调控研究中的利用提供试验依据和理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 植物启动子的基本结构
• 1.1.1 转录起始位点的特点
• 1.1.2 TATA-box
• 1.1.3 CAAT-box
• 1.1.4 GC-box
• 1.1.5 特殊的上游顺式作用元件
• 1.2 植物启动子的类型
• 1.2.1 组成型启动子
• 1.2.2 诱导型启动子
• 1.2.3 组织特异性启动子
• 1.3 启动子克隆与功能分析方法
• 1.4 脂肪酸链延长酶基因FAE1 的研究进展
• 1.5 种子贮藏蛋白NAPIN 的研究进展
• 1.6 本文构想
• 第2章 种子特异表达启动子克隆与序列比较分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 pFAE1 和pNapB 启动子的分离
• 2.2.2 启动子的序列比较分析
• 2.3 讨论
• 第3章 转基因烟草与启动子的功能分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 启动子-GUS 载体构建
• 3.2.2 烟草的遗传转化
• 3.2.3 转基因烟草的分子鉴定
• 3.2.4 转基因烟草的组织化学分析
• 3.2.5 转基因烟草GUS 基因时间表达模式分析
• 3.2.6 转基因烟草GUS 基因空间表达模式分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 烟草的遗传转化
• 3.3.2 FAE1 启动子和NapB 启动子时间表达模式分析
• 3.3.3 FAE1 启动子和NapB 启动子空间特异表达分析
• 第4章 转基因油菜及启动子的功能分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 油菜遗传转化
• 4.2.2 油菜组织化学分析
• 4.2.3 油菜种子中内源 NapB 和 FAE1 启动子时间表达模式分析
• 4.2.4 脂肪酸在油菜胚中的积累
• 4.3 讨论
• 4.3.1 油菜中FAE1 和NapB 基因的时间和空间表达模式分析
• 4.3.2 转基因烟草表达模式与油菜的比较分析
• 4.3.3 油菜种子特异表达启动子与储藏物质积累模式
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录