萍乡红鲫胰蛋白酶提取纯化及酶原前体cDNA克隆、序列分析

论文摘要

本研究运用亲和层析等方法对萍乡红鲫胰蛋白酶进行提取与纯化,并对酶的性质进行了研究；运用分子克隆手段获得了胰蛋白酶原前体基因,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列以及预测的蛋白质高级结构进行了初步分析。主要研究结果如下：1、胰蛋白酶的提取纯化利用硫酸铵分级沉淀、透析、以鸡卵粘蛋白为配基的Sepharose4B-CL亲和层析等方法,得到一种萍乡红鲫胰蛋白酶,经SDS-PAGE分析,该酶的分子量为24kDa。2、pH和温度对胰蛋白酶活性的影响以BAEE（N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯）为底物,研究得出酶的最适温度为50℃、最适pH为7.5。3、胰蛋白酶原前体基因全长cDNA序列利用分子克隆方法从萍乡红鲫中获得胰蛋白酶原前体全长cDNA为866bp,包括5’端非编码区21bp,3’非编码区107bp。4、酶原前体推导氨基酸序列的分析萍乡红鲫胰蛋白酶原前体基因开放阅读框编码246个氨基酸序列,包括15个氨基酸的信号肽和8个氨基酸的激活肽,含有保守的具有催化活性的三联体结构（His63,Asp107和Ser200）和决定底物特异性的必不可少的天冬氨酸残基（Asp194）；具有12个半胱氨酸（Cys,C）残基,可形成6个二硫键。5、酶原前体基因的同源性分析由系统进化树推断,萍乡红鲫与中华倒刺鲃属于同一分支,两者同源性最高。6、酶原前体基因推导蛋白的分析及其结构预测。对由胰蛋白酶原前体cDNA推导的氨基酸序列进行分析,得到蛋白质的分子量Wm=26341.8Da,等电点pI=6.48,其氨基酸组成中丝氨酸（Ser）含量最高,占整个氨基酸数目的13.82%,其次为甘氨酸（Gly）为9.76%;二级结构预测表明该蛋白质二级结构包含四种形式（α-螺旋、延伸链、β-转角、随机卷曲）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 萍乡红鲫简介
• 1.2 胰蛋白酶的研究
• 1.2.1 胰蛋白酶的简介
• 1.2.2 胰蛋白酶分离纯化
• 1.3 鱼类胰蛋白酶的性质研究
• 1.3.1 pH对鱼类胰蛋白酶活性的影响
• 1.3.2 pH对鱼类胰蛋白酶活性的影响
• 1.3.3 鱼类胰蛋白酶分子量的研究
• 1.4 胰蛋白酶（原）基因研究
• 1.4.1 真菌类
• 1.4.2 圆口类
• 1.4.3 两栖类
• 1.4.4 鸟类
• 1.4.5 昆虫类
• 1.4.6 甲壳类
• 1.4.7 哺乳类
• 1.4.8 鱼类
• 1.5 胰蛋白酶的应用研究
• 1.6 本课题研究内容及意义
• 第二章 萍乡红鲫胰蛋白酶的分离与纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 萍乡红鲫胰蛋白酶的分离纯化
• 2.2.2 pH、温度对萍乡红鲫胰蛋白酶活性的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 萍乡红鲫胰蛋白酶的分离纯化
• 2.3.2 pH、温度对萍乡红鲫胰蛋白酶活性的影响
• 第三章 萍乡红鲫胰蛋白酶分子克隆及序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 总RNA的提取
• 3.2.2 中间片段的检测
• 3.2.3 5’末端与3’末端检测
• 3.2.4 萍乡红鲫胰蛋白酶基因cDNA序列分析
• 3.2.5 基因推导蛋白的氨基酸序列比对和系统发生树分析
• 3.2.6 胰蛋白酶氨基酸序列分析
• 3.2.7 胰蛋白酶原前体信号肽与激活肽分析
• 3.2.8 萍乡红鲫胰蛋白酶二级结构预测
• 3.3 讨论
• 3.3.1 总RNA提取
• 3.3.2 胰蛋白酶原的信号肽和激活肽
• 3.3.3 胰蛋白酶氨基酸序列分析及系统进化
• 结论
• 致谢
• 参考文献