兔间充质干细胞分离培养和体外向软骨细胞分化的实验研究

论文摘要

目的1.建立一种分离培养兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymalstem cells,BMSCs）的有效方法,并观察BMSCs在特定培养条件下向软骨细胞分化的情况。2.探讨使用G-CSF动员兔外周血,分离培养外周血间充质干细胞（peripheralblood mesenchymal stem cells,PBMSCs）的方法。方法1.以4月龄新西兰大耳白兔为实验对象,采用密度梯度离心法、全血培养法、氯化胺红细胞溶解法,分离培养BMSCs,对其细胞存活率、细胞克隆率、首次传代时间、15d后细胞数及扩增成功率进行比较。2.用含有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMP）-2的条件培养液诱导BMSCs在体外单层培养模式下向软骨细胞分化。采用甲苯胺蓝染色、Masson染色、免疫组织化学染色、阿利新蓝比色法测定糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）的含量来检测BMSCs分化情况。统计学分析比较第2、4、7代（P2、P4、P7）BMSCs诱导后增殖能力及向软骨细胞分化能力的变化。3.给新西兰兔皮下注射粒细胞集落刺激因子30μg/（kg·d）4d,抽取动员前后兔外周血采用密度梯度离心法进行分离培养。结果1.对于细胞存活率而言,密度梯度离心法和全血培养法均优于氯化胺红细胞溶解法。在其它指标比较中,密度梯度离心法)全血培养法)氯化胺红细胞溶解法。2.BMSCs定向诱导后表现出软骨细胞的特性,P2、P4间的细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力比较差异无统计学意义（P＞0.05）;P7与P2、P4相比,细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力均降低,差异有统计学意义（P＜0.01）。3.未动员的外周血中未发现有梭形细胞贴壁;动员后的外周血中发现有梭形细胞贴壁,而且这些细胞可以形成小的集落,但是增殖缓慢,增殖能力有限,不能大量扩增。结论1.利用成年兔骨髓,体外成功分离出骨髓间充质干细胞,同时发现密度梯度离心法优于全血培养法和氯化胺红细胞溶解法。2.兔BMSCs能在BMP-2为主要诱导因子的单层培养模式下在体外向软骨细胞分化;细胞传代对BMSCs增殖和向软骨细胞分化有重要影响。3.从动员后的外周血中,发现有梭形细胞但它们增殖能力有限,还不能说它们就是间充质干细胞。PBMSCs分离培养有待于进一步研究。

论文目录

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