新疆荒漠昆虫光滑鳖甲抗冻蛋白的性质及功能研究

论文摘要

本研究采用实验室前期从新疆荒漠甲虫光滑鳖甲Anatolica polita体内获得的抗冻蛋白基因Apafp752和Apafp914,构建不同的表达质粒,通过原核表达获得了具有不同标签的重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFPs。采用微升渗透压仪和差示扫描量热仪对ApAFPs的热滞活性（THA）进行测定,同时观察了其对冰晶的修饰作用;通过测定ApAFPs对菌体的体外低温保护作用进一步验证其抗冻活性,并对光滑鳖甲抗冻蛋白的热稳定性、酸碱稳定性及亲水性进行了研究,结果表明ApAFPs具有较强的热稳定性,酸碱耐受性和较高的亲水性。检测了盐溶液NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2;多羟基醇类物质甘油、海藻糖以及羧酸盐Na2CO3、NaAC、柠檬酸钠、EDTA二钠盐对重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752热滞活性的影响。采用圆二色谱法对ApAFPs的二级结构组成进行了测定,建立了ApAFPs的三维结构模型,并利用生物信息学方法分别从氨基酸组成,蛋白序列同源性检索,蛋白序列相似性比对,等电点预测,序列疏水性分析,三级结构预测以及同源进化关系等方面进行预测,系统研究了两种光滑鳖甲抗冻蛋白与其它昆虫抗冻蛋白之间的关系,探讨了其结构与功能之间的关系;同时研究了重组光滑鳖甲抗冻蛋白对鼠红细胞以及乳酸脱氢酶的低温保护作用和抗冻蛋白内源性表达对表达菌自身的低温保护作用。主要研究结果如下:（1）Apafp752在Escherichia coli BL21 （DE3）菌株中可溶性高效表达的融合蛋白Trx-ApAFP752经Ni-NTA亲和层析、离子交换和凝胶过滤层析纯化后纯度达到95%以上,分子量约为30kDa。重组ApAFP752（0.033mM）的热滞值为0.76℃,具有较高的热滞活性和明显的冰晶修饰作用。Trx-ApAFP752可明显提高菌体在低温下的存活率。这种低温保护作用受pH值及蛋白浓度的影响,酸性条件下Trx-ApAFP752对菌体的低温保护作用较弱,而碱性条件可明显提高Trx-ApAFP752对菌体的低温保护作用,并且随着蛋白浓度的增加保护作用也加强。圆二色谱结果表明重组ApAFP752的二级结构主要为β-折叠,在pH2-11的范围内蛋白结构保持稳定,当处理温度达到50℃时结构发生改变;因此,重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752具有较强的酸碱稳定性和一定的热稳定性。（2）采用差示扫描量热仪（DSC）分析重组ApAFP752的量热学特性并对其热滞活性（THA）进行了测定。ApAFP752的THA测定值与溶液中冰核含量有关。当ApAFP752溶液冰核含量小于25.3%时,能够观察到明显的重结晶延滞现象,即当温度降到熔点温度以下溶液才开始结冰,表明ApAFP752具有热滞效应。当溶液冰核含量小于5.1%时,ApAFP752的THA可高达0.76℃。ApAFP752的THA随蛋白浓度的增加而变大,具有明显的浓度效应。采用热重分析仪（TG）对ApAFP752的亲水性进行分析,结果表明ApAFP752具有较强的亲水性。（3）盐离子可明显依数性地增加重组ApAFP752的热滞活性,且二价盐离子溶液的增效作用大于一价盐离子,在低浓度条件下尤为明显。四种羧基化合物的增效作用大小为EDTA>柠檬酸>醋酸钠≥碳酸钠,增效作用与分子中含有的羧基数目相关。两种多羟基物质:甘油、海藻糖的增效作用小于盐离子和羧基化合物,在高浓度下才表现出明显的增效作用。（4）将Anatolica polita抗冻蛋白基因Apafp914分别构建于pET28a和融合绿色荧光蛋白基因的pET28a-egfp载体上,在Escherichia coli中分别以包涵体和可溶形式表达His-ApAFP914和His-EGFP-ApAFP914。绿色荧光蛋白标签的加入增加了ApAFP914的可溶性。0.005mM His-ApAFP914的热滞值为0.67℃,而EGFP-ApAFP914在0.011mM的热滞活性为0.91℃,两种重组ApAFP914在相近摩尔浓度下热滞活性接近,且明显高于ApAFP752;二者也均有明显的冰晶修饰作用。对菌体的低温保护结果表明二者均可明显提高菌体在低温下的存活率,且具有明显的时间效应和浓度效应。相同摩尔浓度下,His-ApAFP914与His-EGFP-ApAFP914的低温保护作用差别不大。二者均具有一定的酸碱稳定性和较高的热稳定性,且重组ApAFP914较ApAFP752具有更高的热稳定性。圆二色谱分析表明His-ApAFP914的主要二级结构为β-折叠,在酸性条件下,β-折叠含量下降,无规卷曲增加,而碱性条件下二级结构组成则较为稳定。（5）ApAFP752和ApAFP914与其它鞘翅目昆虫AFPs的序列相似性远远大于与鳞翅目昆虫AFP的相似性。在同源进化树上可以看出ApAFP914与小胸鳖甲抗冻蛋白亲缘关系较近,而ApAFP752的变异性较大。ApAFP752分子内含有两个TCI基序而非TCT结构,且疏水区面积大于ApAFP914。圆二色谱分析结果表明构成两种ApAFPs的主要二级结构成分为β-折叠,而ApAFP914的β-折叠含量要大于ApAFP752,且无规卷曲含量很低,推测其空间结构更加紧致,有序。ApAFP752和ApAFP914在三级结构上与黄粉虫抗冻蛋白TmAFP相似,都形成右手β-螺旋结构。ApAFP914由含有TCT基序的氨基酸重复序列构成的螺圈数要多于ApAFP752,使之具有更大的冰晶结合表面积,且蛋白N-端具有二硫键更为封闭。冰晶结合表面积的不同以及结构的差异可能是造成二者热滞活性及热稳定性差异的原因。（6）重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914可提高红细胞对-3℃低温耐受的同时,提高了经低温处理后的细胞对渗透胁迫的抗性。rApAFP914也可显著降低4℃处理红细胞的溶血率,并且这种保护作用随蛋白浓度的升高而增大,具有一定的浓度效应。初步推测rApAFP914通过与冰核吸附结合阻止冰晶生长,同时与红细胞膜结合保护膜完整性而发挥低温保护作用。（7）通过测定体内可溶性表达重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914的表达菌对不同低温的耐受性,以及经低温处理后的生长曲线,表明体内rApAFP914的积累能够显著提高表达菌在低温下的存活率,并且随着诱导剂浓度及诱导时间的延长,对菌体的保护效果也增强。为进一步揭示ApAFP914在天然昆虫体内的作用机制奠定了基础。（8）重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFPs对反复冻融的乳酸脱氢酶LDH有显著的低温保护作用,且具有一定的浓度效应,高浓度重组ApAFP752对LDH的保护活性要高于重组ApAFP914。

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ABSTRACT

第一部分文献综述

第一章昆虫抗冻蛋白结构与功能关系的研究

1 超强的抗冻活性

2 规则的一级结构

3 相似的冰晶结合表面

4 昆虫AFPs 的起源与演化

参考文献

第二章昆虫抗冻蛋白作用机理的研究进展

1 吸附-抑制理论

2 影响AFP 热滞活性的因素

2.1 AFP 与不同冰晶表面结合的影响

2.2 AFP 分子大小的影响

2.3 AFP 溶解度的影响

2.4 增效剂对AFP 热滞活性的影响

3 AFPs 与细胞膜的作用机制

参考文献

第三章抗冻蛋白在低温保护生物学领域的研究进展

1 AFP 对动物胚胎低温保护作用的研究

1.1 动物胚胎低温保存技术及影响因素

1.2 AFP 在动物胚胎低温保存中的应用

1.3 AFP 应用于动物胚胎低温保存的展望

2 AFP 对真核细胞和脏器的低温保护作用及保护机理研究

2.1 在0-4℃低温下的保护作用

2.2 在零下低温的保护作用

2.3 AFP 在低温保存中的作用机理

3 AFP 在食品冷冻保鲜领域的应用前景

4 转基因抗冻生物的研究进展

4.1 AFP 转基因动物的研究

4.2 AFP 转基因植物的研究

参考文献

第二部分新疆荒漠昆虫光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP 的表达与性质研究

第一章光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752 的原核表达及性质研究

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.2 常规溶液

1.3 引物设计与合成

1.4 抗冻蛋白基因Apafp752 的克隆

1.5 原核表达载体的构建

1.6 融合蛋白TrxA-ApAFP752 的表达、SDS-PAGE 检测及纯化

1.7 蛋白印迹分析

1.8 融合蛋白TrxA-ApAFP752 的热滞活性测定

1.9 体外低温保护活性分析

1.10 pH 稳定性和热稳定性

1.11 三维结构模型建立

2 结果

2.1 ApAFP752 的序列分析

2.2 原核表达载体的构建

2.3 TrxA- ApAFP752 的表达及纯化

2.4 TrxA-ApAFP752 对冰晶形态的修饰作用

2.5 体外低温保护活性分析

2.6 pH 稳定性和热稳定性

2.7 ApAFP752 的三维结构预测

3 讨论

参考文献

第二章光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752 的热力学性质研究

1 材料与方法

1.1 重组抗冻蛋白ApAFP752 的制备

1.2 差示扫描量热（DSC）分析

1.3 热重分析

1.4 圆二色光谱分析

2 结果

2.1 差示扫描量热（DSC）分析

2.2 热重分析

2.3 CD 光谱分析

3 讨论

参考文献

第三章小分子物质对重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752 的增效作用

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 重组ApAFP752 的制备

1.3 热滞活性测定

2 结果

2.1 盐离子对ApAFP752 的增效作用

2.2 羧基化合物对ApAFP752 的增效作用

2.3 多羟基化合物对ApAFP752 的增效作用

3 讨论

参考文献

第四章两种重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914 的比较研究

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.2 His-ApAFP914 的引物设计与合成

1.3 EGFP-ApAFP914 的引物设计与合成

1.4 抗冻蛋白基因Apafp914 和绿色荧光蛋白基因egfp 的PCR 扩增

1.5 原核表达载体pET28a-Apafp914 的构建

1.6 原核表达载体pET28a-egfp-Apafp914 的构建

1.7 感受态细胞的制备及转化

1.8 重组蛋白His-ApAFP914 的表达及SDS-PAGE 检测

1.9 重组蛋白His-ApAFP914 包涵体的复性及纯化

1.10 重组蛋白EGFP-ApAFP914 的表达及SDS-PAGE 检测与纯化

1.11 重组蛋白ApAFP914 的蛋白印迹分析

1.12 两种重组ApAFP914 的热滞活性测定及冰晶形态观察

1.13 两种重组ApAFP914 的体外低温保护活性分析

1.14 pH 稳定性和热稳定性检测

1.15 His-ApAFP914 的圆二色光谱分析

1.16 ApAFP914 三维结构模型建立

2 结果

2.1 ApAFP914 的序列分析

2.2 原核表达载体pET28a-Apafp914 的构建

2.3 原核表达载体pET28a-egfp-Apafp914 的构建

2.4 His-ApAFP914 的表达及纯化

2.5 EGFP-ApAFP914 的表达与纯化

2.6 重组ApAFP914 的热滞活性测定及冰晶形态观察

2.7 重组ApAFP914 体外低温保护活性分析

2.8 两种重组ApAFP914 的pH 稳定性和热稳定性

2.9 His-ApAFP914 的CD 光谱分析

3 讨论

参考文献

第五章光滑鳖甲抗冻蛋白生物信息学研究及结构与功能的比较

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 序列比对、疏水性及等电点分析方法

1.3 圆二色光谱分析

1.4 三维结构模型建立

2 结果与分析

2.1 氨基酸序列同源性检索

2.2 序列分析

2.3 同源进化树的构建

2.4 疏水性分析

2.5 二级结构测定

2.6 三维结构预测

3 讨论

参考文献

第三部分重组光滑鳖甲抗冻蛋白的低温保护应用研究

第一章重组光滑鳖甲抗冻蛋白内源性表达对菌体低温存活的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 感受态细胞的制备及转化

1.3 重组蛋白EGFP-ApAFP914 在菌体中的表达及检测

1.4 表达菌低温存活率的测定

1.5 低温处理后表达菌的生长曲线

2 结果

2.1 重组蛋白在菌体中的表达及检测

2.2 表达菌低温存活率的测定

2.3 低温处理后表达菌的生长曲线

3 讨论

参考文献

第二章重组光滑鳖甲抗冻蛋白改善哺乳动物红细胞的低温保存

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914 的制备

1.3 红细胞的制备

1.4 重组ApAFP914 对红细胞的毒性检测

1.5 抗冻蛋白对低温保存红细胞的保护分析

1.6 红细胞渗透性分析

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 rApAFP914 对红细胞的毒性分析

2.2 rApAFP914 对零下低温-3℃处理的红细胞的保护作用

2.3 rApAFP914 对4℃处理的红细胞的保护作用

3 讨论

参考文献

第三章重组光滑鳖甲抗冻蛋白对反复冻融的乳酸脱氢酶活性影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 重组光滑鳖甲抗冻蛋白的制备

1.3 重组光滑鳖甲抗冻蛋白的热滞活性测定

1.4 测定使乳酸脱氢酶LDH 失活的冻融次数

1.5 重组光滑鳖甲抗冻蛋白对LDH 的低温保护分析

2 结果

2.1 重组光滑鳖甲抗冻蛋白的热滞活性测定

2.2 LDH 失活冻融次数的确定

2.3 重组ApAFPs 对LDH 活性影响

3 讨论

参考文献

第四部分结论与展望

1、新疆荒漠甲虫光滑鳖甲抗冻蛋白的表达及性质研究

2、光滑鳖甲抗冻蛋白的低温保护应用研究

附录1 英文缩略语

附录2 主要实验仪器

致谢

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攻读博士学位期间发表学术论文

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