叶锈菌与TcLr19小麦互作体系中2个病程相关蛋白基因的克隆及分析

论文摘要

植物病程相关蛋白（Pathogenesis-related proteins,PRs）是指植物在病理或病理相关环境下诱导产生的一类蛋白,在多种植物中已有报道。为了深入研究小麦抗叶锈病机制,本研究利用RT-PCR和RACE技术,从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中获得病程相关蛋白1基因（TcLr19PR1）和β-1,3-葡聚糖酶基因（TcLr19Glu）的cDNA全长;并利用实时荧光定量PCR技术对小麦与叶锈菌亲和及非亲和组合中TcLr19PR1和TcLr19Glu基因的表达模式进行了分析;同时构建了含有TcLr19PR1、TcLr19Glu基因的重组载体,通过基因枪介导法分别对小麦感病材料离体叶片和幼嫩胚性愈伤组织进行了转化。主要内容包括以下几个方面:1.以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr19和叶锈菌菌株07-10-421-3为材料,以接菌后各时间点的小麦叶片总RNA的等量混合物为模板,利用RT-PCR和RACE技术获得TcLr19PR1和TcLr19Glu的cDNA全长。2.以接种叶锈菌的TcLr19和Thatcher叶片为材料,应用半定量PCR和qRT-PCR技术检测亲和与非亲和组合中TcLr19PR1和TcLr19Glu的表达模式。结果表明,TcLr19PR1在非亲和组合中接种12h表达量达到最大,然后有所下降,但整体水平高于亲和组合。TcLr19Glu在非亲和组合中12h表达水平开始明显上调,在36h表达量达到最大,但各时间点表达量均高于未接菌对照及亲和组合。3.以TcLr19小麦基因组DNA为模板,通过PCR技术获得TcLr19PR1的DNA序列。Southern杂交验证说明TcLr19PR1在小麦基因组中为低拷贝。并利用“中国春”缺体-四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上。4.为了研究β-1,3-葡聚糖酶在小麦抗叶锈病中的作用,接种叶锈菌后检测TcLr19与Thatcher中葡聚糖酶活性。结果显示,感病亲本Thatcher接菌后0-144h之间葡聚糖酶活性缓慢升高,在144h达到最大,整体变化不明显。抗病材料TcLr19接菌48h范围内β-1,3-葡聚糖酶活性水平明显升高,48h达到高峰,整体表达水平比Thatcher高。5.将TcLr19PR1和TcLr19Glu基因分别定向插入到单子叶表达载体pAHC25中,获得重组质粒pAHC-TcLr19PR1和pAHC-TcLr19Glu。利用瞬间表达技术分析TcLr19PR1和TcLr19Glu基因与抗叶锈相关性,结果显示TcLr19PR1和TcLr19Glu基因的导入在一定程度上抑制叶锈菌菌丝的生长。6.基因枪介导法将重组质粒pAHC-TcLr19PR1和pAHC-TcLr19Glu转化感病材料郑州5389小麦的幼嫩胚性愈伤组织,经分化筛选后获得再生小麦植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物病程相关蛋白基因的研究进展
• 1.1.1 植物病程相关蛋白的定义及分类
• 1.1.2 病程相关蛋白与植物抗性
• 1.1.3 病程相关蛋白1 基因
• 1.1.4 β-1,3-葡聚糖酶基因
• 1.2 实时荧光定量PCR 研究进展及其在植物上的应用
• 1.3 小麦遗传转化方法
• 1.3.1 基因枪法
• 1.3.2 农杆菌介导法
• 1.3.3 花粉管通道法
• 1.4 研究的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料、试剂及仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小麦抗叶锈病近等基因系TcLr19 及感病亲本Thatcher 接种试验
• 2.2.2 小麦叶片总RNA 的提取及cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 TcLr19 小麦病程相关蛋白基因片段的分离
• 2.2.4 病程相关蛋白基因TcLr19PR1、TcLr19Glu 全长cDNA 的获得
• 2.2.5 TcLr19 小麦病程相关蛋白基因的半定量分析
• 2.2.6 TcLr19 小麦病程相关蛋白基因实时荧光定量表达分析
• 2.2.7 TcLr19PR1 基因的DNA 序列克隆及染色体定位
• 2.2.8 TcLr19PR1 基因拷贝数的验证
• 2.2.9 β-1,3-葡聚糖酶活性测定
• 2.2.10 TcLr19 小麦病程相关蛋白基因瞬时表达分析
• 2.2.11 TcLr19 小麦病程相关蛋白基因的转化及转基因植株再生
• 3 结果与分析
• 3.1 TcLr19 小麦中病程相关蛋白基因片段的获得
• 3.1.1 小麦叶片总RNA 的提取
• 3.1.2 TcLr19 小麦病程相关蛋白1 基因片段的分离
• 3.1.3 TcLr19 小麦β-1,3-葡聚糖酶基因片段的分离
• 3.2 小麦TcLr19PR1基因全长cDNA的获得
• 3.2.1 RACE
• 3.2.2 TcLr19PR1 基因全长cDNA 的核苷酸及其推导氨基酸序列分析
• 3.3 TcLr19PR1 基因组DNA 扩增及分析
• 3.4 TcLr19PR1 基因染色体定位分析
• 3.5 TcLr19PR1 基因的拷贝数验证
• 3.6 小麦TcLr19Glu 基因全长cDNA 的获得
• 3.6.1 RACE
• 3.6.2 TcLr19Glu 基因全长及其推导氨基酸序列分析
• 3.7 β-1,3-葡聚糖酶活性测定
• 3.8 半定量RT-PCR 分析
• 3.9 实时荧光定量PCR 分析
• 3.9.1 TcLr19PR1 实时定量PCR 表达分析
• 3.9.2 TcLr19Glu 实时定量PCR 表达分析
• 3.10 目的基因植物表达载体的构建
• 3.10.1 转基因表达载体pAHC-TcLr19PR1 的构建
• 3.10.2 转基因表达载体pAHC-TcLr19Glu 的构建
• 3.11 目的基因与叶锈菌的互作
• 3.12 小麦胚性愈伤组织培养各阶段及转化子筛选结果
• 4 讨论
• 4.1 叶锈菌与TcLr19 小麦互作体系中的TcLr19PR1 基因
• 4.2 叶锈菌与TcLr19 小麦互作体系中的TcLr19PR1 基因
• 4.3 小麦遗传转化体系的优化
• 4.4 展望与发展
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢