玉米赤霉烯酮降解菌的筛选、鉴定以及降解机理研究

论文摘要

玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）,又称F-2毒素,是一种由镰刀菌产生的类雌激素样真菌毒素。该毒素广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物的籽粒以及奶类中。ZEN具有类雌性激素毒性,不仅影响食物安全而且可以通过食物链在人体或动物体中造成蓄积,进而危害人和动物的健康。目前对于ZEN的脱毒处理主要借助于一些物理、化学和生物学手段破坏或降低其毒性。由于生物学方法可以克服传统的物理和化学方法中存在的种种弊端,因而利用生物学手段进行真菌毒素脱毒处理则是近年来研究的热点和焦点。运用生物学方法筛选降解毒素的高效降解菌并将其应用于实践,对保护人民身体健康,降低粮食、畜牧业的经济损失有积极意义。本论文主要通过对ZEN降解菌株的筛选,获得具有ZEN降解能力的菌株,并研究该菌株的ZEN降解能力、降解机理及其降解影响因素。本论文共包含四个部分。第一部分,ZEN的提纯HPL检测条件的优化。通过对ZEN毒素提纯条件的优化,为ZEN降解菌的筛选提供较纯的降解底物；HPLC检测条件的优化,为ZEN降解率测定提供了灵敏、可靠的分析方法和试验数据,同时也保证了后续实验的顺利进行。结果表明,优化的ZEN提取条件为,试验采用甲醇和NaCl溶液为提取剂、超声提取,湿填硅胶小柱净化,简化了样品前处理步骤,提高了净化效果。优化的HPLC检测条件为,流动相为甲醇和水（80/20,V/V）,流速为0.6ml·min-1,紫外检测波长为236nm,最低检出限为5μg·kg-1,在1.25～40.00μg·ml-1范围内,被测ZEN浓度与测定的峰面积呈线性关系（r=0.9991）；通过对检测方法加标回收实验,得到该检测方法回收率约为96.3%。第二部分,ZEN降解菌株的筛选与鉴定。从受小麦赤霉病长期污染的土壤中富集筛选到一株ZEN降解菌,试验发现该菌株具有较强的ZEN降解能力。通过对该菌株进行形态观察,生理生化特性测定及其系统发育地位的分析,该菌株被初步鉴定为该菌株属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）,其16S rDNA序列在GenBank上的登录号为HM372880。本实验室将其命名为：玉米赤霉烯酮降解菌（zearalenonedegradation bacterium, ZDS）。第三部分,观察了外界因素对降解率的影响。主要的影响因素有温度、培养基初始pH值、摇床转速、接种量、装液量等。结果发现,ZDS对ZEN降解的最适条件是：温度为30℃、pH值为7.0、摇床转速180rpm、接种量5%、装液量20ml·50ml-1。该菌株在最适降解条件下,能够在一周内完全降解浓度为50ppm的ZEN且随着ZEN浓度的增高降解率逐渐降低,当ZEN浓度高于100ppm时,降解率几乎为0。最后,对菌株降解机理进行了初步的探讨。利用硫酸铵沉淀的方法确定沉淀降解活性物质,同时对沉淀的降解活性物质粗提液部分特性进行初步研究。结果表明,用饱和度为40%的硫酸铵进行沉淀,降解活性物质粗提液的降解活性最强,并初步确定菌株ZDS降解ZEN过程中起降解作用的活性物质主要存在于菌液上清中。该降解活性物质在温度为25℃、pH值为7.0时降解活性最强。综上所述,菌株ZDS对真菌毒素ZEN有较强的降解能力,其降解机理是菌株ZDS产生降解活性物质对ZEN进行降解,并且降解能力受反应温度、pH值、装液量、接种量等外界因素的影响。菌株ZDS可作为潜在的生物脱毒剂,应用于生产实践中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1. 玉米赤霉烯酮的概述
• 1.1 玉米赤霉烯酮的污染
• 1.2 玉米赤霉烯酮的产生条件
• 1.3 玉米赤霉烯酮的结构及理化性质
• 1.4 玉米赤霉烯酮的毒性
• 1.5 玉米赤霉烯酮的毒性机理
• 1.6 玉米赤霉烯酮的限量标准
• 2. 玉米赤霉烯酮的检测方法
• 2.1 色谱检测法
• 2.2 酶联免疫检测法（ELISA）
• 2.3 微生物检测法
• 3. 玉米赤霉烯酮的防治措施
• 3.1 玉米赤霉烯酮的预防措施
• 3.2 玉米赤霉烯酮的脱毒处理
• 3.3 生物降解研究的进展
• 4. 本研究的目的
• 第二章 玉米赤霉烯酮的提纯与检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果与讨论
• 2.1 玉米赤霉烯酮的培养、提取、纯化方法的优化
• 2.2 玉米赤霉烯酮HPLC检测的条件优化
• 2.3 标准曲线的制作及线性关系
• 2.4 方法的回收率和精密度
• 3. 结论
• 第三章 玉米赤霉烯酮降解菌的筛选与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 污染土壤中玉米赤霉烯酮降解菌的分离、筛选
• 2.2 降解菌的菌落形态及生理生化特征
• 2.3 降解菌的分子鉴定
• 3. 结论
• 第四章 降解菌发酵条件及降解因素优化
• 1. 材料与方法
• 1.1. 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 玉米赤霉烯酮降解菌发酵条件的优化
• 2.2 外界条件对降解率的影响
• 2.3 玉米赤霉烯酮降解谱的测定
• 2.4 化学药剂多菌灵和戊唑醇对降解率的影响
• 3. 结论
• 第五章 菌株降解机理的初步研究
• 1. 材料与方法
• 1.1. 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 玉米赤霉烯酮降解菌降解活性物质分布
• 2.2 硫酸铵饱和度的确定
• 2.3 解活性物质反应进程曲线
• 2.4 活性物质作用的最适反应温度
• 2.5 活性物作用的最适pH值
• 3. 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢