野油菜黄单胞菌8004菌株wxc基因簇的功能分析

论文摘要

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）是一种能在全球范围内引起所有十字花科植物黑腐病的重要病原细菌。脂多糖是该菌与致病相关的生化因子之一,在Xcc B100菌株中wxc基因簇参与了LPS的O-抗原和核心多糖的合成。全基因组测序分析表明Xcc 8004有着与Xcc B100不同的WXC基因簇。为明确在Xcc 8004中该基因簇的功能,构建了其中wxcN、rmd、wzt和XC3621等4个基因的整合突变体PK3620、NK3626、NK3632和NK3621,并检测了这些突变体的致病力、LPS和EPS等表型特征。SDS-PAGE分析显示NK3626的带型与8004差异显著,推测基因rmd可能参与LPS核心多糖的合成。致病性试验发现PK3620和NK3626致病力均降低到8004的50%以下,经过反式互补其致病力又回复到野生型的71.7%和90.3%;EPS摇瓶发酵试验也显示PK3620、NK3626和NK3632的EPS产量显著降低,反式互补后其EPS产量分别回复和超过了野生型菌株的水平。由此证实在Xcc8004菌株的wxc基因簇中,基因wxcN和rmd同时与致病性和EPS合成密切相关,而基因wzt仅与EPS合成相关。另外本研究显示突变体NK3621的多种表型特征与8004野生型菌株相比并无明显变化,因此基因XC3621的确切功能尚待进一步研究。

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 植物病原细菌Xcc的概述
• 1.2 植物病原菌的致病生化因子
• 1.2.1 多糖
• 1.2.2 毒素
• 1.2.3 生长激素
• 1.2.4 胞外酶
• 1.2.5 依赖于Hrp TTSS的效应蛋白分子
• 1.3 胞外多糖（EPS）的研究进展
• 1.3.1 胞外多糖的结构
• 1.3.2 胞外多糖的生物合成及调控
• 1.3.3 胞外多糖与致病性
• 1.4 脂多糖（Iipopolysaccharide,LPS）的研究进展
• 1.4.1 脂多糖的基本结构和化学组成
• 1.4.2 脂多糖的生物合成
• 1.4.3 脂多糖的生物学功能
• 1.4.4 Xcc脂多糖研究进展
• 1.4.4.1 目前Xcc中发现的与LPS合成相关的基因
• 1.4.4.2 脂多糖致病作用的研究
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 抗生素和其它药品
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液与缓冲液
• 2.1.5 试材
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株培养条件及保存
• 2.2.2 PCR反应
• 2.2.2.1 引物设计
• 2.2.2.2 模板制备
• 2.2.2.3 反应体系
• 2.2.2.4 反应条件：
• 2.2.2.5 PCR扩增产物检测
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 DNA操作
• 2.2.4.1 总DNA的提取
• 2.2.4.2 质粒的提取
• 2.2.4.2.1 快速碱裂解法少量提取质粒DNA
• 2.2.4.2.2 质粒DNA的大量提取
• 2.2.4.3 DNA的纯化和DNA的沉淀
• 2.2.4.4 限制性内切酶酶（?）
• 2.2.4.5 DNA片段的试剂（?）回收
• 2.2.4.6 DNA连接
• 2.2.5 转化
• 2.2.5.1 电脉冲感受态细胞的制备
• 2.2.5.2 电脉冲转化
• 2.2.6 整合突变体构建的技术路线
• 2.2.7 三亲本接合
• 2.2.8 脂多糖（LPS）分析
• 2.2.9 胞外多糖的检测
• 2.2.9.1 胞外多糖的平板检测
• 2.2.9.2 胞外多糖的摇瓶发酵检测
• 2.2.10 胞外酶的检测
• 2.2.10.1 胞外蛋白酶的检测
• 2.2.10.2 胞外淀粉酶的检测
• 2.2.10.3 胞外纤维素酶的检测
• 2.2.11 植株试验
• 2.2.11.1 致病性试验
• 2.2.11.2 过敏反应试验
• 第三章 结果与分析
• 3.1 wxc基因簇概况
• 3.2 基因wxcN、XC3621、rmd和wzt的序列分析
• 3.3 基因wxcN、XC3621、rmd和wzt的整合突变体的构建
• 3.3.1 5’端DNA同源片段的扩增
• 3.3.2 将各基因5’端DNA同源片段克隆到pK18mob上
• 3.3.3 三亲接合和整合突变体的验证
• 3.4 整合突变体PK3620、NK3626和NK3632的功能互补
• 3.4.1 互补基因片段的扩增
• 3.4.2 将互补基因片段C3620、C3626和C3632分别克隆到质粒pLAFR3上
• 3.4.3 三亲接合和互补菌株的验证
• 3.5 wxc基因簇的功能分析与鉴定
• 3.5.1 致病性试验
• 3.5.2 过敏反应试验
• 3.5.3 基本培养基上的生长繁殖情况
• 3.5.4 检测致病生化因子
• 3.5.4.1 LPS表型检测
• 3.5.4.2 EPS表型检测
• 3.5.4.3 胞外酶表型检测
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 对Xcc B100和8004两菌株的wxc基因簇的比较分析
• 4.2 关于wxc基因簇内各基因整合突变体的构建
• 4.3 关于wxc基因簇的功能
• 参考文献
• 致谢