蛋鸡TRPV6基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

论文摘要

TRPV6 （transient receptor potential vanilloid receptor 6）是瞬时性受体电位通道TRP（transient receptor potential）超家族中的成员,最早发现于小鼠的十二指肠,是专门的上皮样通道,具有高度的Ca2+选择性,作为Ca2+向细胞内转运的限速通道,广泛分布于哺乳动物Ca2+转运组织：肠道、肾、卵巢、骨等。鉴于TRPV6在钙代谢中的重要作用,本文旨在克隆表达蛋鸡TRPV6蛋白,并制备多克隆抗体,为更深入研究蛋鸡钙代谢紊乱造成的多种疾病奠定基础。本试验从蛋鸡卵巢中提取总RNA,并应用RT-PCR方法克隆得到原鸡TRPV6编码基因（Genbank登录号,XM-416530）,将获得的PCR产物连至pMD18-T克隆载体,转化E.Coli感受态细胞,提取质粒,进行双酶切鉴定以及DNA序列测定。结果表明,扩增得到375 bp的TRPV6基因片段,扩增片段与GenBank上报道的预测序列具有很高的相似性,达到99%,氨基酸序列相似性为100%。其开放阅读框（ORF）起始于第一个碱基,终止于最后一个碱基,无信号肽,编码124个氨基酸。将扩增产物连至组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-32a（+）-TRPV6,并转化入BL21 （DE3）中,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳检测分析,表达产物为35 kD的重组蛋白；超声破碎细菌后分析表明,原核表达产物主要以包涵体形式存在。Western-blot分析表明重组蛋白能与抗组氨酸抗体（anti-his antibody）相结合,具有反应特异性。将重组蛋白用Ni2+螯合柱纯化,经SDS-PAGE蛋白电泳分析无杂蛋白后,作为免疫原免疫新西兰雄兔,经过四次免疫后,收集抗血清,应用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,经间接ELISA检测到多克隆抗体的效价达到1：105。Western-blot分析表明,纯化的蛋白与兔抗血清可特异性结合；细胞免疫化学结果显示,成骨细胞免疫化学鉴定为阳性；组织免疫化学分析表明,兔抗血清可与组织内天然TRPV6蛋白特异性结合；从鸡长骨骨骺端提取蛋白,经Western-blot鉴定,所制备的抗血清能与天然TRPV6蛋白结合,免疫反应特异性良好。试验证明,该多克隆抗体可应用于细胞、组织免疫化学以及组织蛋白Western-blot的鉴定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 前言
• 上篇 文献综述
• 第一章 蛋鸡体内的钙代谢与骨质疏松症的关系
• 1 笼养蛋鸡骨质疏松症的简介
• 2 蛋鸡体内的钙稳态
• 2.1 肠道对钙稳态的调节
• 2.2 肾对钙稳态的调节
• 2.3 骨对钙稳态的调节
• 3 钙调节相关的激素和蛋白
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 TRPV6的研究进展
• 1 TRPV6概述
• 2 TRPV6的组织分布
• 3 TRPV6基因及蛋白结构
• 4 TRPV6的激活和失活方式
• 5 影响TRPV6表达的相关因素
• 6 TRPV6与骨代谢关系
• 7 小结
• 参考文献
• 下篇 试验研究
• 第三章 蛋鸡TRPV6活性区基因的克隆
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 英文摘要
• 第四章 TRPV6活性区基因的原核表达、纯化及鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 英文摘要
• 第五章 抗蛋鸡TRPV6多克隆抗体的制备及应用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 英文摘要
• 全文总结
• 本论文创新之处
• 攻读硕士期间发表论文
• 致谢