固体发酵黑曲霉产单宁酶的研究

论文摘要

单宁酶全称是单宁酯酰水解酶（Tannase,EC 3.1.1.20）,它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键,生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶用途广泛,主要来源于微生物,目前研究得较多较为深入的是青霉和黑曲霉。本论文利用紫外诱变的方法选育到一株产单宁酶的黑曲霉菌株,对该菌株固体发酵产单宁酶的发酵工艺条件及发酵培养基进行了优化,研究确立了固体发酵所产单宁酶的酶活检测方法,论文还对产单宁酶的黑曲霉菌株发酵产单宁酶的固定化进行了研究。本研究采用紫外诱变的菌种选育手段进行黑曲霉菌株的诱变,用在平板培养基中加入微量的的溴酚蓝（0.004%）,利用黑曲霉生长形成的变色圈大小对菌株进行筛选,成功的选育到了一株产单宁酶达92U/mL的黑曲霉高产菌株。它的单宁酶活性较原始出发菌株提高了1倍多。论文首先研究和建立了适合固体发酵所产胞外单宁酶活性的检测方法。此方法是根据没食子酸（单宁酶催化没食子酸丙酯水解产生）与甲醇绕丹宁之间形成色团物质的方法来测定单宁酶的活性,没食子酸丙酯做底物显色明显,选择520nm波长下检测,成功的避开了干扰物质的吸收峰波长,减小了误差,该方法对底物纯度要求低,常规实验室的仪器就能进行检测,具有简便直观、灵敏准确、重复性好的特点。对选育的产单宁酶黑曲霉菌株进行固体发酵产单宁酶研究,结果表明产单宁酶的最适氮源为NH4NO3,对发酵培养基进行单因素优化结果表明:每5g培养基基质含1%NH4NO3;0.1%NaCl;0.1%MgSO4;8%五倍子;90%麸皮.对发酵条件的单因素优化后得到:初始水分含量50%,初始ph6.0,温度30℃为最佳产酶条件。利用响应面方法对显著影响产单宁酶的培养基及培养条件因素进行优化,得到固体发酵黑曲霉诱变株最佳产单宁酶酶条件为:五倍子含量为9.5%;氮源NH4NO3添加量为2.3%;温度为32℃。在此最佳发酵条件下发酵产单宁酶达219.4U/mL。对发酵产单宁酶进行固定化研究,以海藻酸钠为固定化单宁酶的载体,采用交联-包埋-交联的方法对单宁酶进行固定化.对前交联戊二醛浓度,前交联时间、温度,海藻酸钠浓度,CaCl2浓度,硬化时间,后交联戊二醛浓度,后交联时间、温度等固定化工艺进行研究,对固定化单宁酶的性质进行了初步研究.

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 单宁酶的性质
• 1.2.1 单宁酶的理化性质
• 1.2.2 单宁酶的酶学性质
• 1.3 单宁酶分离纯化及菌株筛选
• 1.4 单宁酶的酶活力测定
• 1.5 单宁酶的固定化
• 1.5.1 固定化酶的方法和特性
• 1.5.2 单宁酶的固定化
• 1.6 单宁酶的应用
• 1.6.1 应用于食品工业
• 1.6.2 制革工业
• 1.6.3 饲料工业
• 1.6.4 化妆品工业
• 1.6.5 精细化工与制药工业
• 1.7 本课题立题意义和研究内容
• 1.7.1 本课题的立题意义
• 1.7.2 本课题的研究内容
• 第二章 产单宁酶黑曲霉菌株的诱变及筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料与设备
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 实验菌种的培养及初步鉴定
• 2.3.2 出发菌株的筛选
• 2.3.3 紫外诱变
• 2.3.4 复筛方法
• 2.3.5 粗酶液的提取
• 2.3.6 酶活测定方法
• 2.3.7 单宁酶高活性菌株的产酶稳定性
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 实验菌种的初步鉴定
• 2.4.2 出发菌株的筛选
• 2.4.3 紫外诱变筛选单宁酶高活性菌株
• 2.4.4 单宁酶高活性菌株产酶稳定性
• 2.5 本章小结
• 第三章 单宁酶活力测定方法的构建
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 仪器
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 没食子酸吸收峰波长
• 3.3.2 没食子酸标准曲线及其回归方程
• 3.3.3 单宁酶活力测定
• 3.3.4 单宁酶活力测定方法比较
• 3.4 本章小结
• 第四章 固体发酵黑曲霉产单宁酶研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 试剂
• 4.2.4 仪器
• 4.2.5 实验方法
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 液体发酵法与固体发酵法的比较
• 4.3.2 黑曲霉产单宁酶固体发酵单因素条件研究
• 4.3.3 响应面优化结果
• 4.4 单宁酶产酶活力曲线
• 4.5 结论
• 第五章 单宁酶的固定化
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 单宁酶粗酶液的提取
• 5.3.2 单宁酶酶活测定
• 5.3.3 以海藻酸钠为载体固定化单宁酶固定化方法的选择
• 5.3.4 固定化单宁酶条件的优化
• 5.3.5 固定化酶性质的研究
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 海藻酸钠为载体固定化单宁酶固定化方法的选择
• 5.4.2 固定化单宁酶的条件研究
• 5.4.3 固定化酶的最适温度
• 5.4.4 固定化酶的热稳定性
• 5.4.5 固定化酶的最适ph
• 5.4.6 固定化酶的贮藏稳定性
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文情况