哈茨木霉Chit37基因与Thi4基因的克隆与表达

论文摘要

丝状土壤真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）作为一种优秀的生防因子具有广泛的作用谱,在生物防治和环境保护方面发挥着重要作用。为了从基因组水平上探讨其生防机理并挖掘生防相关新基因,本实验室以胶态几丁质为唯一碳源,构建哈茨木霉（T. harzianum）菌丝体时期诱导表达的cDNA文库并获得1,386条EST序列（序列号:DY761370DY762921）,通过生物信息学分析成功获得了2条新基因（几丁质酶基因Chit37和噻唑生物合成酶基因Thi4 ）, GenBank序列接受号分别为DQ647957和DQ647956。Chit37基因的氨基酸序列含有几丁质酶18家族保守活性位点“FDGIDIDIE”,该基因家族因具有降解几丁质活性而在植物病害生物防治、海洋垃圾降解及资源的再生利用过程中发挥着重要作用,全新碱性几丁质酶基因Chit37的开发和研究将丰富基因资源,为高效工程菌的构建提供重要材料。Chit37基因原核表达优化条件为0.1mmol/L IPTG诱导培养8h,这一结果对于后续研究及大规模发酵具有重要的指导意义。通过穿梭质粒pYES2实现基因Chit37在酿酒酵母（S. cerevisiae）H158中的外源表达,考虑到非翻译区域对表达产物的可能影响,使用两种目的片段Chit37-I（包含非翻译区的全长序列）和Chit37-II（只含有开放读码框序列）;半定量RT-PCR结果表明,Chit37-I在诱导后96h和108h表达量较高,而Chit37-II则在诱导后84h和96h mRNA转录水平较高。DNS法检测转化子发酵周期,当接种比例为1:100时CHIT37-I和CHIT37-II转化子的产酶高峰分别为第108h和96h,最适反应温度、pH值及底物浓度均为40℃、5.0及5%,CHIT37-II具有发酵周期短、酶活性高且对底物浓度适应范围广等特点而在大规模发酵生产中更具优势,对于非翻译区作用的探讨将有助于今后对Chit37基因的合理利用。构建表达载体pPKTCP,利用根癌农杆菌介导法转入生防真菌哈茨木霉（T. harzianum）中,分子生物学检测表明,Chit37基因以单拷贝形式整合到哈茨木霉基因组DNA中且都能够稳定遗传,转化子对病原菌的抑制率显著高于原始菌株,对六种病原菌的拮抗能力由强至弱分别是核盘菌（S. sclerotiorum）、立枯丝核菌（R. solani）、尖镰孢菌（F. oxysporum）、齐整小核菌（S. rolfsii）、茄腐镰刀菌（F. moniliforme）、和灰霉病菌（B. cinerea）。这一结果说明CHIT37具有抗真菌活性并在哈茨木霉生物防治过程中发挥着重要作用,转化子可直接以菌剂形式应用于病害防治,具有非常重要的理论意义和实际应用价值,并有助于促进生物防治的产业化进程。Thi4基因与Thi4家族具有较高的同源性,该基因家族的功能与逆境胁迫相关,作为维生素B1生物合成途径中的关键酶而间接参与有机体新陈代谢,同时噻唑作为多种农药内核被广泛应用于农业生产。因此,Thi4基因的研究对生物法大量生产维生素B1、生物合成新型超高效农药及环境可持续发展都具有十分重要的意义。基因原核表达优化条件为0.1mmol/L IPTG诱导4h;将基因构建到穿梭质粒pYES2上实现在酿酒酵母（S. cerevisiae）H158中的外源表达,Northern杂交分析表明该基因可经半乳糖诱导转录表达,酵母高效工程菌株的构建为工业化生产酶制剂提供了材料和依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题研究的目的和意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 粮食危机与植物病害
• 1.2.2 木霉在植物病害生物防治中的应用
• 1.2.3 几丁质酶研究进展
• 1.2.4 噻唑生物合成酶研究进展
• 1.2.5 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化
• 1.3 目前研究中存在的问题
• 1.4 课题来源与主要研究内容
• 1.4.1 课题来源
• 1.4.2 主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因克隆与序列分析
• 2.2.2 重组质粒的转化与鉴定
• 2.2.3 原核表达载体构建与鉴定
• 2.2.4 诱导表达条件优化与蛋白纯化
• 2.2.5 酿酒酵母表达载体构建
• 2.2.6 酿酒酵母转化子分子检测
• 2.2.7 酿酒酵母转化子酶学特性
• 2.2.8 真菌表达载体构建与哈茨木霉遗传转化
• 2.2.9 哈茨木霉转化子的分子检测
• 2.2.10 哈茨木霉转化子遗传稳定性及抑菌活性
• 第3章 几丁质酶基因Chit37 序列分析与原核表达
• 3.1 基因Chit37 的序列分析
• 3.1.1 基因Chit37 全长cDNA 序列的获得
• 3.1.2 基因Chit37 序列同源性比较与保守区预测
• 3.1.3 CHIT37 基本性质分析
• 3.1.4 CHIT37 信号肽预测
• 3.1.5 CHIT37 多序列比对
• 3.1.6 CHIT37 氨基酸结构域预测
• 3.1.7 CHIT37 系统进化树的构建
• 3.2 几丁质酶基因Chit37 的原核表达
• 3.2.1 基因Chit37 的PCR 扩增结果
• 3.2.2 基因Chit37 原核表达载体构建
• 3.2.3 重组质粒的菌落PCR 鉴定
• 3.2.4 重组质粒的双酶切鉴定
• 3.2.5 重组质粒的测序鉴定
• 3.2.6 CHIT37 诱导表达条件优化
• 3.2.7 CHIT37 的纯化
• 3.3 关于基因Chit37 的序列分析与原核表达的讨论
• 3.3.1 全长cDNA 序列获取方法的选择
• 3.3.2 几丁质酶基因DNA 测序及分析递交
• 3.3.3 几丁质酶基因和推导氨基酸序列的生物信息学分析
• 3.3.4 基因原核表达中存在的问题
• 3.3.5 融合蛋白的纯化
• 3.4 本章小结
• 第4章 几丁质酶基因Chit37 酵母表达
• 4.1 用于酿酒酵母表达的基因片段获得
• 4.2 酿酒酵母表达载体构建
• 4.3 酿酒酵母的生长曲线
• 4.4 酵母转化子的筛选与鉴定
• 4.4.1 酵母转化子的筛选
• 4.4.2 酵母转化子菌落PCR 鉴定
• 4.4.3 酵母转化子酶切鉴定
• 4.5 酵母转化子的分子检测
• 4.5.1 酵母总RNA 提取
• 4.5.2 基因Chit37 诱导表达差异分析
• 4.5.3 酵母转化子的Northern 杂交
• 4.6 酿酒酵母转化子诱导表达
• 4.7 酿酒酵母转化子的酶学特性
• 4.7.1 标准曲线的绘制
• 4.7.2 酿酒酵母转化子的最佳培养时间测定
• 4.7.3 重组几丁质酶最适反应温度测定
• 4.7.4 重组几丁质酶最适pH 值测定
• 4.7.5 重组几丁质酶最适底物浓度测定
• 4.8 关于酿酒酵母转化子的表达、检测与酶学特性的讨论
• 4.8.1 酿酒酵母表达载体的选择
• 4.8.2 真核细胞中重组蛋白的表达
• 4.8.3 目的基因的转化及酵母转化子的鉴定
• 4.8.4 酿酒酵母转化的影响因素
• 4.8.5 酿酒酵母RNA 提取
• 4.8.6 酿酒酵母转化子分子检测的方法
• 4.8.7 关于几丁质酶基因表达和酶活检测的讨论
• 4.8.8 微生物产几丁质酶的影响条件
• 4.9 本章小结
• 第5章 农杆菌介导Chit37 在哈茨木霉中的转化
• 5.1 表达载体pPKPCT 的构建
• 5.1.1 中间载体pUC-T 的构建
• 5.1.2 中间载体pUC18-TP 的构建与鉴定
• 5.1.3 中间载体pUC18-TPC 的构建与鉴定
• 5.1.4 表达载体pPKPCT 的构建与鉴定
• 5.1.5 重组质粒pPKPCT 转化根癌农杆菌AGL-1
• 5.2 农杆菌介导的哈茨木霉遗传转化
• 5.2.1 哈茨木霉转化子的获得与鉴定
• 5.2.2 哈茨木霉转化子的Southern 杂交
• 5.2.3 哈茨木霉转化子遗传稳定性检测
• 5.2.4 哈茨木霉转化子与病原菌室内拮抗试验
• 5.3 关于真菌遗传转化的讨论
• 5.4 本章小结
• 第6章 噻唑生物合成酶基因Thi4 克隆与表达
• 6.1 噻唑生物合成酶基因Thi4 的克隆及序列分析
• 6.1.1 基因Thi4 的克隆
• 6.1.2 THI4 氨基酸序列同源性比较及保守性分析
• 6.1.3 THI4 氨基酸组成分析
• 6.1.4 THI4 疏水性分析及跨膜结构预测
• 6.1.5 THI4 二级结构预测
• 6.1.6 THI4 三级结构预测
• 6.1.7 THI4 氨基酸功能位点预测
• 6.1.8 THI4 多序列比对
• 6.1.9 THI4 系统进化树的构建
• 6.2 噻唑生物合成酶基因Thi4 的原核表达
• 6.2.1 基因Thi4 的PCR 扩增结果
• 6.2.2 原核表达载体的构建
• 6.2.3 重组质粒菌落PCR 鉴定
• 6.2.4 重组质粒双酶切鉴定与测序鉴定
• 6.2.5 诱导表达条件优化
• 6.3 噻唑生物合成酶基因Thi4 的酵母表达
• 6.3.1 用于酿酒酵母表达的基因片段获得
• 6.3.2 酿酒酵母表达载体构建与鉴定
• 6.3.3 酵母转化子菌落PCR 鉴定
• 6.3.4 酵母转化子酶切鉴定
• 6.3.5 酵母转化子Northern 杂交
• 6.4 关于噻唑生物合成酶基因表达的讨论
• 6.4.1 SDS-PAGE 分析中出现的问题
• 6.4.2 噻唑生物合成酶的功能验证问题
• 6.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 个人简历