银川油葫芦和多伊棺头蟋线粒体基因组序列测定与分析

论文摘要

直翅目属于节肢动物门、六足总纲、昆虫纲,是一类较常见的昆虫,包括蝗虫、蟋蟀、螽蜥、蝼蛄等昆虫,分为蝗亚目和螽亚目,前者包括蜢总科、蝗总科、蚱总科和蚤蝼总科,后者包括蝼蛄总科、螽蜥总科和蟋蟀总科。目前针对直翅目的系统发育关系尚未形成统一的系统。本研究采用基于长PCR的二次PCR策略。直接测序和克隆测序相结合的方法,对蟋蟀总科的两种昆虫银川油葫芦和多伊棺头蟋线粒体基因组全序列进行测定*、拼接和注释。通过联合GenBank收录的7种已测昆虫（包括直翅目蝼蛄总科的东方蝼蛄Gryllotalpaorientalis、蝗总科斑翅蝗科的非洲飞蝗Locusta migratoria和螽蜥总科的Anabrus simplex,蜚蠊目的黑胸大蠊Periplaneta fuliginosa,螳（虫+修）目的Sclerophasma paresisense,螳螂目的Tamolanica tamolana,襀翅目的Pteronarcys princeps）线粒体基因组数据和本实验室28种已测直翅目昆虫,采用系统发育学研究方法,对直翅目昆虫系统发育关系进行研究,探讨COⅠ、COⅡ、COⅢ基因系统发育有效性。主要结论如下:1、所测两种直翅目昆虫银川油葫芦和多伊棺头蟋的线粒体基因组长度分别为15499bp和15392bp,均包括13种蛋白质基因、22种tRNA基因、2种rRNA基因和A+T丰富区。2、所测银川油葫芦和多伊棺头蟋线粒体基因组在基因顺序上与果蝇的大体一致,除了tRNA-Glu和tRNA-Asn基因排序与果蝇不同,且tRNA-Ser[S-AGN]在N链上,两种蟋蟀存在E-[（?）]-N转位,这是目前在直翅目中发现的第三种线粒体基因排列方式。银川油葫芦线粒体基因组中存在20处基因间重叠总长度达123bp,基因间隔区有7处达32bp;多伊棺头蟋基因组中存在19处基因间重叠总长度达125bp,基因间隔区8处总长度达88bp。3、银川油葫芦和多伊棺头蟋线粒体基因组的蛋白编码基因、rRNA基因和tRNA基因均存在很强的碱基A+T含量偏向性,整个线粒体基因组序列存在很高的A+T含量偏向性,其中A+T丰富区的A+T含量最高,远远高于整体序列的A+T含量,分别为:77.0%和77.3%,这符合昆虫mtDNA控制区碱基组成偏向性的特征。4、银川油葫芦和多伊棺头蟋线粒体基因组13种蛋白质基因除了COⅠ基因的起始密码子为TCG外都使用了ATN作为起始密码子;除银川油葫芦的ND5、COⅢ基因和多伊棺头蟋的ND1、COⅢ基因以单独的TA作为终止密码子外,其余的蛋白质编码基因都以完整的三联密码子TAA或TAG作为终止密码子。蛋白质基因的氨基酸组成中Leu、Ser、Ile、Phe的含量很高。5、除tRNA-Ser[S-AGN]缺失了D-臂外,其余的tRNA基因二级结构都可以折叠成典型的三叶草结构,反密码子和多数六足动物一致,多为GNN或UNN。反密码子环和氨基酸接受臂非常保守,其它臂环的变异较大。在tRNA二级结构的4个臂上均存在不同程度的碱基错配,错配类型多为G-U配对。2个rRNA基因中12S rRNA较为保守,16S rRNA二级结构的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ结构与螽蜥相比较为保守。6、对31种昆虫线粒体的蛋白质编码基因COⅠ、COⅡ、COⅢ数据集以及100中昆虫COⅠ基因,使用最大节约方法（MP,Maximum Parsimony）、最大似然方法（ML,MaximumLikelihood）、贝叶斯法（Bayesian,BI）重建直翅目系统发育关系。研究表明,直翅目、蟋蟀总科和螽蜥总科具有单系性,所选用的数据集对直翅目蝗总科的系统发育关系缺乏解析力。100-CO1 DNA序列数据集构建的系统发育树表明BI法结果对直翅目昆虫系统发育的分析较理想。采用MP、ML和BI法研究表明除了31-CO3外,31-CO1、31-CO2和31-CO123三个数据集构建的螽蜥总科和蟋蟀总科聚为姐妹群,且蟋蟀总科的亲缘关系与形态学的分类一致。31-CO1、31-CO2和31-CO123这三个数据集采用三种不同的建树方法都不能很好的对蝗总科各科属间亲缘关系进行很好的解析。在这些分析中,MP法、BI法和ML法中系统发育有效性依次均是COⅠ、COⅡ、COⅢ。蛋白质编码基因系统发育性能好差与基因长度和蛋白质的功能有关,还与分类单元的取样多少有关。本研究首次对直翅目蟋蟀总科的银川油葫芦和多伊棺头蟋基因组进行了序列测定、拼接和线粒体基因组注释和分析。发现了直翅目中的第三种线粒体基因排列方式。结合已经测出的直翅目昆虫共计31种线粒体基因组序列的编码COⅠ、COⅡ、COⅢ基因序列的核苷酸和蛋白质序列进行系统发育分析。本研究丰富了直翅目昆虫线粒体基因组数据,为进一步开展昆虫线粒体谱系基因组学的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1 线粒体DNA及其进化
• 1.1 线粒体的半自主性
• 1.2 线粒体的结构特征
• 1.3 线粒体的进化
• 2 昆虫线粒体基因组的研究进展概况
• 2.1 基因组学的相关概念简介
• 2.2 节肢动物线粒体基因组的研究进展
• 2.3 直翅目及其线粒体基因组概况
• 3.分子系统学研究方法
• 3.1 DNA序列比对
• 3.2 建树方法简介与比较
• 3.3 数据组总体系统发育信号的检验
• 3.4 进化树分支可靠性和置信度的检验
• 4 蟋蟀总科简介
• 4.1 蟋蟀总科简介
• 4.2 蟋蟀科简介
• 4.3 本研究使用的标本介绍
• 5 研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 标本的采集、保存与鉴定
• 1.2 实验仪器和试剂
• 2 实验方法
• 2.1 总DNA提取
• 2.2 总DNA检测
• 2.3 PCR引物设计及PCR扩增
• 2.4 Sub-PCR扩增产物测序
• 3 序列编辑及校正
• 3.1 测序结果的片段拼接
• 3.2 线粒体基因组序列的基因定位与注释
• 3.3 线粒体基因组基因组成情况的分析
• 3.4 RNA的二级结构的预测
• 4 直翅目昆虫的线粒体系统发育分析
• 4.1 序列数据来源
• 4.2 序列比对
• 4.3 序列组成分析
• 4.4 数据组系统发育信号检验
• 4.5 建树方法
• 第三部分 实验结果
• 1 基因组总DNA提纯
• 2 长PCR（L-PCR）扩增和纯化
• 3 二次PCR扩增和纯化
• 4 二次PCR产物测序
• 5 序列拼接
• 第四部分 银川油葫芦线粒体基因组
• 1 粒体基因组的结构组成及基本特征
• 1.1 基因组结构化与基因顺序
• 1.2 基因重叠区和基因间隔序列
• 1.3 线粒体基因组核苷酸组成特征
• 2 线粒体基因组蛋白质基因
• 2.1 蛋白质基因碱基组成偏向性
• 2.2 蛋白质基因密码子的使用
• 2.3 蛋白质基因氨基酸组成
• 3 tRNA基因
• 4 rRNA基因
• 5 控制区
• 第五部分 多伊棺头蟋线粒体基因组
• 1 粒体基因组的结构组成及基本特征
• 1.1 基因组结构化与基因顺序
• 1.2 基因重叠区和基因间隔序列
• 1.3 线粒体基因组核苷酸组成特征
• 2 线粒体基因组蛋白质基因
• 2.1 蛋白质基因碱基组成偏向性
• 2.2 蛋白质基因密码子的使用
• 2.3 蛋白质基因氨基酸组成
• 3 tRNA基因
• 4 rRNA基因
• 5 控制区
• 第六部分 系统发育构建结果分析和讨论
• 1 昆虫纲100种CO Ⅰ基因序列比对结果数据集组成分析
• 1.1 100种昆虫CO Ⅰ基因数据的特征
• 1.2 昆虫纲100种CO Ⅰ基因全序列组成及变异
• 1.3 100种昆虫之间CO Ⅰ基因的遗传距离
• 1.4 碱基替换饱和性分析
• 1.5 100种昆虫数据集系统发育信号PTP检验
• 1.6 g1检验
• 2 直翅目31种昆虫CO Ⅰ、CO Ⅱ、CO Ⅲ基因序列比对结果数据集组成分析
• 2.1 CO Ⅰ、CO Ⅱ、CO Ⅲ基因实验数据的处理及序列比对
• 2.2 CO Ⅰ、CO Ⅱ、CO Ⅲ基因全序列组成及变异
• 2.3 CO Ⅰ、CO Ⅱ、CO Ⅲ遗传距离
• 2.4 CO Ⅰ、CO Ⅱ、CO Ⅲ密码子使用情况
• 2.5 CO Ⅰ、CO Ⅱ、CO Ⅲ以及联合数据集系统发育信号检验
• 3 构建系统发育树
• 3.1 简约法建树
• 3.2 极似然法建树
• 3.3 贝叶斯系统发育推论法建树
• 4 构建系统发育树结果
• 4.1 简约法建树
• 4.2 贝叶斯法建树
• 4.3 极似然法建树
• 5 系统树构建结果分析
• 5.1 直翅目31种昆虫CO Ⅰ、CO Ⅱ、CO Ⅲ基因序列数据集系统发育结果分析
• 5.2 100种昆虫CO Ⅰ基因序列数据集系统发育结果分析
• 第七部分 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果
• 附件