生物法制备丙烯酸的研究

论文摘要

丙烯酸（acrylic acid）是一种重要的化工原料,目前主要靠石油化工方法生产,然而该法具有其它化学制备方法所共有的缺点。因此,研究和探索丙烯酸的生物合成途径,利用生物方法制备丙烯酸是十分必要的。自然界中丙烯酸的生成一般有如下两种方式：1)通过碳数的改变,形成丙烯或丙酸骨架,再通过官能团进一步修饰,生成丙烯酸；2)在三碳的骨架上改性生成丙烯酸。本文分别以粪产碱杆菌,红球菌和丙酸梭菌为出发菌株,尝试使用三种不同的方法生物制备丙烯酸：通过构建粪产碱杆菌的基因组文库,克隆筛选粪产碱杆菌二甲基巯基丙酸裂解酶基因,在大肠杆菌表达载体pET-22b中表达,期望获得阳性克隆,并实现二甲基巯基丙酸向丙烯酸的转化。但主要由于基因组文库库容和筛选量不够,未能实现预期结果。以红球菌基因组为模板,成功克隆了酰胺酶基因ami,构建质粒pET-22b,在大肠杆菌（E.col） BL21（DE3）中获得表达。对酰胺酶表达量,比酶活和酶的最适温度,pH值进行了探索,结果表明ami基因在大肠杆菌中表达后,有一定量包涵体存在,酰胺酶最适温度为37℃,pH为7.0；蛋白比酶活可达到2.8U/mg,蛋白表达量可达1.7mg/ml。为提高酰胺酶的表达量和酶活,以枯草芽孢杆菌为表达宿主,选择5个调控强度不同的启动子（amyE, sacB, p43, degQ, aprE）分别表达酰胺酶,比较酰胺酶的表达量和酶活,结果表明以amyE为启动子ami基因表达效率最高,比酶活可达8.7U/mg,表达量可达2.3mg/L,比原始菌提高了4倍。在最适温度37℃,最适pH值7.0时,6小时内丙烯酸的转化率可达到90%。同时在丙酸梭菌中成功表达了乳酸脱水酶lcd和辅酶A转移酶pct。在5L发酵罐初步发酵丙酸梭菌,实现了乳酸到丙烯酸的转化。为研究生物法制备丙烯酸奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 丙烯酸简介
• 1.1.1 丙烯酸的理化性质
• 1.1.2 丙烯酸的用途
• 1.1.3 丙烯酸的市场情况
• 1.1.4 丙烯酸的生产方法
• 1.1.4.1 丙烯氧化法
• 1.1.4.2 乙炔羰基化路线（REPPE法）
• 1.1.4.3 丙烯腈水解法
• 1.1.4.4 乙烯氧化羰基化合成法
• 1.1.4.5 氰乙醇法
• 1.1.4.6 乙烯酮法
• 1.2 微生物生产丙烯酸的研究进展
• 1.2.1 可产生丙烯酸的微生物
• 1.2.2 粪产碱杆菌中生产丙烯酸的代谢途径
• 1.2.3 红球菌中生产丙烯酸的代谢途径
• 1.2.4 丙酸梭菌中生产丙烯酸的代谢途径
• 1.3 基因文库技术分离目的基因
• 1.3.1 基因文库的类别
• 1.3.2 核基因组文库构建核基因组文库构建
• 1.3.3 利用PCR技术构建cDNA文库
• 1.3.4 应用差别杂交或扣除杂交法构建cDNA文库
• 1.3.5 人工染色体文库
• 1.4 存在的问题及展望
• 1.5 实验目的
• 第二章 粪产碱杆菌基因文库的构建及二甲基巯基丙酸裂解酶（DMSPLYASE）的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 试剂和仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 培养方法
• 2.3.2 ALCALIGENESFAECALIS基因组DNA的提取
• 2.3.3 DNASE Ⅰ酶切粪产碱杆菌基因组DNA
• 2.3.4 PET-22B质粒的提取
• 2.3.5 PET-22B质粒的酶切
• 2.3.6 PET-22B质粒5’的去磷酸化
• 2.3.7 粪产碱杆菌DNA文库的构建
• 2.3.8 阳性克隆的筛选
• 2.4 结果和讨论
• 2.4.1 粪产碱杆菌全基因组电泳
• 2.4.2 DNASE Ⅰ酶切条件的确定
• 2.4.3 PET-22B的酶切
• 2.4.4 粪产碱杆菌基因组DNA文库的构建
• 2.4.5 粪产碱杆菌DNA文库的筛选
• 2.5 小结
• 第三章 红球菌酰胺酶基因在大肠杆菌的克隆和表达
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株、质粒和引物
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 试剂和仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 培养方法
• 3.3.2 R.ERYTHROPOLI基因组DNA的提取
• 3.3.3 聚合酶链式反应扩增基因AMI
• 3.3.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离基因AMI
• 3.3.5 质粒PMD 18-T-AMI的构建
• 3.3.6 质粒PMD 18-T-AMI转化大肠杆菌
• 3.3.6.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.3.6.2 连接产物的乙醇沉淀
• 3.3.6.3 重组质粒电击转化大肠杆菌
• 3.3.7 质粒PMD 18-T-AMI的鉴定
• 3.3.7.1 蓝白斑筛选阳性重组子
• 3.3.7.2 质粒的酶切鉴定
• 3.3.7.3 序列测定和分析
• 3.3.8 质粒PET-22B的酶切及去磷酸化
• 3.3.9 质粒PET-22B-AMI的构建
• 3.3.10 质粒PET-22B-AMI的鉴定
• 3.3.10.1 菌落PCR筛选阳性重组子
• 3.3.10.2 酶切鉴定
• 3.3.10.3 序列测定和分析
• 3.3.11 AMI基因在大肠杆菌的表达
• 3.3.11.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定重组蛋白
• 3.3.11.2 诱导时间的选择
• 3.3.11.3 酰胺酶蛋白表达部位
• 3.3.11.4 诱导温度对酰胺酶活性的影响
• 3.3.12 酰胺酶最适酶活测定
• 3.3.13 酰胺酶表达量及比酶活的测定
• 3.4 结果和讨论
• 3.4.1 R.ERYTHROPOLI基因组DNA的提取
• 3.4.2 聚合酶链式反应扩增基因AMI
• 3.4.3 质粒PMD 18-T-AMI的鉴定
• 3,4.3.1 双酶切鉴定
• 3.4.3.2 序列测定和分析
• anti 的鉴定'>3.4.4 质粒 pET-22b^anti 的鉴定
• 3.4.4.1 菌落PCR
• 3.4.4.2 双酶切鉴定
• 3.4.4.3 序列测定和分析
• 3.4.5 基因AMI在大肠杆菌的表达
• 3.4.5.1 诱导时间的选择
• 3.4.6 重组大肠杆菌中酰胺酶酶活的测定
• 3.4.7 大肠杆菌中表达的酰胺酶比活和表达量的测定
• 3.5 小结
• 第四章 红球菌酰胺酶基因在枯草芽孢杆菌的克隆和表达
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌种与质粒
• 4.2.2 试验试剂及仪器设备
• 4.2.3 培养基和溶液
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 枯草芽孢杆菌基因组的提取
• 4.3.2 AMYE启动子信号肽的克隆
• 4.3.3 AMI基因的PCR扩增
• 4.3.4 AMYE启动子信号肽与AMI基因的连接
• 4.3.5 质粒PMD 18-T-AMYE-AMI的构建
• 4.3.6 序列测定和分析
• 4.3.7 质粒PGJ103-AMYE-AMI的构建和鉴定
• 4.3.8 枯草感受态细胞的制备
• 4.3.9 重组质粒电击转化枯草芽孢杆菌
• 4.3.10 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达
• 4.3.11 在AMYE启动子调控下,酰胺酶活性和表达量的测量
• 4.3.12 启动子对酰胺酶在枯草芽孢杆菌中表达的影响
• 4.3.13 蛋白质浓度测定
• 4.3.14 超滤
• 4.3.15 液相色谱测定产物浓度
• 4.3.16 酰胺酶转化率的测定
• 4.3.17 枯草芽孢杆菌中AMYE,SACB,APRE,DEGQ启动子的序列分析
• 4.4 结果和讨论
• 4.4.1 AMI基因,AMYE,SACB,P43,APRE和DEGQ启动子的克隆
• 4.4.2 重组表达载体的构建
• 4.4.3 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达
• 4.4.4 酰胺酶酶活最适条件的测定
• 4.4.5 不同宿主表达酰胺酶的比酶活和表达量
• 4.4.6 酰胺酶摩尔转化率的测定
• 4.5 小结
• 五、乳酸辅酶A转移酶及乳酸辅酶A脱水酶在丙酸梭菌中的表达制备丙烯酸
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 丙酸梭菌的厌氧培养
• 5.3.2 丙酸梭菌基因组的提取
• 5.3.3 丙酸梭菌中乳酸辅酶A转移酶及乳酸辅酶A脱水酶的克隆
• 5.3.4 PMD-18T测序鉴定
• 5.3.5 质粒PGJ103-LCDB-PCT的构建
• 5.3.6 丙酸梭菌的电转化
• 5.3.7 丙酸梭菌阳性克隆的厌氧发酵
• 5.3.8 丙烯酸的液相测定
• 5.3.9 PGJ103质粒在丙酸梭菌中稳定性的测定
• 5.3.10 质谱检测发酵产物
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 丙酸梭菌基因组的提取
• 5.4.2 乳酸脱水酶的B亚基及乳酸CoA转移酶PCT基因的克隆
• 5.4.3 丙酸梭菌阳性克隆的厌氧发酵
• 5.4.4 PGJ103质粒在丙酸梭菌中稳定性的测定
• 5.4.5 质谱检测发酵产物
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 第七章 问题与建议
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 附件