论文摘要
由各种外伤原因所导致的周围神经损伤或者断裂,会给伤者造成肢体感觉和运动功能的下降或者丧失。对于周围神经断裂类的损伤,若断裂缺口较大时,就须借助于对缺口进行桥接移植手术才能使断裂了的周围神经得到再生修复。目前采用的移植体有自体移植体和神经支架,但自体移植来源有限且会带来供体部位的后遗症。在神经支架研究方面,由于非降解材料可能导致神经压迫和二次手术的必要性,所以近年的工作主要趋向于生物可降解支架材料的研究和开发。截至2006年底,美国FDA已经批准了NeuraGen、SaluBridge、Neurolac、Neuro Matrix、Neuroflex和Neurotube等品牌的神经导管用于临床;我国也有几家单位正在申报国家三类医疗器械批文。尽管如此,由于所使用的材料不同,其促周围神经损伤修复的效果也很有差异;同时,它们基本都不适用于长段神经缺损的修复,故开展神经支架的研究仍有必要。基于以上原因,本论文拟研制出一种以猪皮来源的细胞外基质（ECM）粉末和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（PLGA）为主要原料、对神经生长因子（NGF）有缓慢释放功能的促周围神经损伤修复的支架;通过体外检测及动物实验来评估其作为促周围神经损伤修复支架的可行性。具体内容主要包括以下几个方面:①制备出了猪皮来源的ECM粉末。经H.E染色及扫描电子显微镜观测,没有观测到细胞残留;经琼脂糖凝胶电泳分析,未检测到核酸残留。②制备出了具有生物活性的NGF明胶微球。经激光粒径分布仪检测,微球的粒径介于1μm和20μm之间,平均粒径主要分布在8μm和12μm之间;毛细管电泳检测结果显示微球对NGF的封载率为80.50%。③通过添加弱碱性物质,达到了中和PLGA在降解过程中所产生的酸性产物以稳定组织pH的目的。对于纯的PLGA,随着降解时间的推移,降解液的pH值逐渐下降;不同种类的弱碱性调节剂与PLGA复合后都能对降解液的pH起到一定的调节作用,但效果各异;相同种类的弱碱性添加剂对降解液pH的影响与添加百分比相关;碳酸氢钠的调节作用最明显,使降解液的pH值一直处于碱性状态;壳聚糖的调节功效相对较平稳缓慢,使降解液的pH值一直处于酸性状态和平稳下降趋势;而碱性氨基酸添加剂的作用则处于中间状态,先使降解液上调成碱性,然后再下调为酸性,使降解液的pH值保持在中性附近;当组氨酸的添加量为5%和10%时,对降解液pH的影响差异不显著;而当添加剂为精氨酸和赖氨酸时,在高添加剂量下其对降解液pH值的影响比在低添加剂量下的作用更显著;当赖氨酸的添加量为5%时,在试验考察期内,其使降解液的pH值保存在7.286.62间,是最适合的添加方式。④通过对由PLGA和ECM的不同混合比例所制备的支架进行比较发现,随着支架中ECM含量的增加,材料中的孔隙的在形态及孔径的大小分布上越不均匀;材料的断裂强度逐渐增大,当ECM含量在达到20-30%时为最大值,然后逐渐降低;材料的断裂伸长率逐渐降低;吸水率逐渐增大;失重率逐渐增大;降解速率逐渐增大。综合评价认为,材料中ECM的最佳含量应在20-30%。⑤通过对不同组织工程原材料的筛选以及配伍比例的探讨和制备方法的摸索,制备出了目标支架。⑥体外测试结果显示,本目标支架的断裂强度为8.308MPa,断裂伸长率为38.98 %,弹性模量为77.27 MPa。扫描电子显微镜观测发现,支架中PLGA和ECM发生了物理共混并形成了蜂窝状结构。在8周的考察期内,支架质量损失了15.6%,羟脯氨酸的累计释放率为62.8%。在第30d仍能检测到支架对NGF的释放。扫描电子显微镜观测结果显示雪旺氏细胞（SC）能够在支架上粘附、穿行。⑦动物实验初步实验结果显示,本目标支架在兔坐骨神经部位生物相容性良好,无炎症反应,无过敏反应。通过对动物实施本目标支架移植后,在术后第5周术部神经实现了愈合,在术部神经的愈合中有雪旺氏细胞的参与。综上所述,本支架具有对NGF进行缓慢释放的功能并保持了NGF的生物活性;无细胞毒性,并对雪旺氏细胞的生长有促进作用;其三维结构为雪旺氏细胞在支架中的穿行提供了前提;其力学指标和生物可降解特性符合神经支架的要求;在支架中添加弱碱性物质是中和PLGA在降解过程中所产生的酸性物质的有效方法。本支架的力学性质、生物活性、生物相容性、生物可降解性符合神经支架的要求,可以作为一种候选的神经支架。
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摘要ABSTRACT1 绪论1.1 研究的目的及意义1.1.1 研究的目的1.1.2 研究的意义1.2 国内外研究现状1.2.1 周围神经概述1.2.2 促周围神经损伤修复支架的研究概述1.2.3 材料在促周围神经损伤修复支架中的应用1.2.4 促周围神经损伤修复支架应该具有的性质1.2.5 促周围神经损伤修复支架的外层结构1.2.6 促周围神经损伤修复支架的内部基质1.2.7 促周围神经损伤修复支架的发展方向1.3 论文设计1.3.1 论文设计的思想1.3.2 论文的研究内容1.4 预期结果2 ECM 粉末的制备及其评价2.1 引言2.2 实验部分2.2.1 主要仪器及设备2.2.2 主要试剂及材料2.2.3 对猪皮的去细胞处理2.2.4 形体学观测2.2.5 ECM 基因组DNA 残留分析2.2.6 ECM 粉末的制备2.3 结果与讨论2.3.1 ECM 的形态学观测2.3.2 ECM 基因组DNA 残留分析2.4 本章小结3 NGF 明胶微球的制备3.1 引言3.2 实验部分3.2.1 主要仪器3.2.2 主要试剂3.2.3 空白明胶微球的制备3.2.4 NGF 明胶微球的制备3.2.5 微球的形态学观察及粒径分布3.2.6 NGF 明胶微球对NGF 封载率的测定3.3 结果与讨论3.3.1 微球的形态及粒径分布3.3.2 NGF 明胶微球对NGF 的封载率3.4 本章小结4 几种构建神经支架原料的力学性质的比较4.1 引言4.2 实验部分4.2.1 主要仪器及设备4.2.2 主要试剂及材料4.2.3 试件的制备4.2.4 力学测试4.3 结果及讨论4.4 本章小结5 碱性氨基酸调节PLGA 体外降解特性的研究5.1 引言5.2 实验部分5.2.1 主要材料及设备5.2.2 样品的制作5.2.3 样品的体外降解实验5.2.4 数据处理5.3 结果与讨论5.3.1 碱性添加剂对PLGA 降解过程中pH 特性的影响5.3.2 碱性添加剂对PLGA 降解过程中质量损失特性的影响5.4 本章小结6 PLGA 和ECM 的比例对支架理化性质的影响6.1 引言6.2 实验部分6.2.1 主要材料及设备6.2.2 PLGA-ECM 支架的制备6.2.3 PLGA-ECM 支架的力学性质评价6.2.4 PLGA-ECM 支架的形态学观测6.2.5 PLGA-ECM 支架的的体外降解行为考察6.3 结果与讨论6.3.1 PLGA 与ECM 的不同比例对支架力学性质的影响6.3.2 PLGA 与ECM 的不同比例对支架结构的影响6.3.3 PLGA 与ECM 的不同比例对支架吸水率及降解性质的影响6.4 本章小结7 NGF 促周围神经损伤修复支架的制备及其理化性质检测7.1 引言7.2 实验部分7.2.1 主要仪器及设备7.2.2 主要试剂及材料7.2.3 NGF 促周围神经损伤修复支架的制备7.2.4 NGF 促周围神经损伤修复支架的力学测试7.2.5 NGF 促周围神经损伤修复支架的形态学观测7.2.6 NGF 促周围神经损伤修复支架的体外降解及对NGF 的释放速率检测7.3 结果与讨论7.3.1 NGF 促周围神经损伤修复支架的形态学观测7.3.2 NGF 促周围神经损伤修复支架的力学性质7.3.3 NGF 促周围神经损伤修复支架的降解性质7.3.4 NGF 促周围神经损伤修复支架对NGF 的缓释性质7.4 本章小结8 NGF 促周围神经损伤修复支架的生物安全性评价8.1 引言8.2 实验部分8.2.1 主要材料及设备8.2.2 供试液的制备8.2.3 过敏性试验8.2.4 动物急性（单剂量）毒性8.2.5 皮肤致敏试验8.2.6 皮内刺激试验8.2.7 热源试验8.2.8 溶血试验8.2.9 短期肌肉植入试验8.3 结果与讨论8.3.1 过敏性试验8.3.2 动物急性（单剂量）毒性8.3.3 皮肤致敏试验8.3.4 皮内刺激试验8.3.5 热源试验8.3.6 溶血试验8.3.7 短期肌肉植入试验8.4 本章小结9 NGF 促周围神经损伤修复支架与雪旺氏细胞的共培养9.1 引言9.2 实验部分9.2.1 主要仪器及设备9.2.2 主要试剂及材料9.2.3 雪旺氏细胞的原代培养及鉴定9.2.4 雪旺氏细胞在NGF 促周围神经损伤修复支架上的黏附9.2.5 NGF 促周围神经损伤修复支架对雪旺氏细胞增殖的影响（MTT）9.3 结果与讨论9.3.1 雪旺氏细胞的原代培养及鉴定9.3.2 MTT 实验结果9.3.3 雪旺氏细胞在NGF 促周围神经损伤修复支架上的黏附9.4 本章小结10 动物实验10.1 引言10.2 实验部分10.2.1 主要材料及设备10.2.2 动物模型的建立10.3 结果与讨论10.4 本章小结11 全文结论11.1 主要结论11.2 后续工作建议致谢参考文献附录A. 作者在攻读博士学位期间发表论文情况B. 参加科研项目情况C. 实验动物使用许可证明
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