牛肝碱性磷酸酶的分离纯化、部分性质和功能基团及固定化研究

论文摘要

以新鲜的牛肝为材料,经匀浆、Tris-HCl缓冲液抽提、正丁醇除脂、热变性、超滤、DEAE-Sepharose离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,分离纯化出牛肝碱性磷酸酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测该酶已达到电泳纯。纯化倍数达228.74倍,比活为19863.50U／mg.经SDS-PAGE和凝胶过滤测得该酶的亚基分子量为59 Kd,全分子量为118 Kd。以磷酸苯二钠为底物,测得该酶的最适pH为10.0,最适温度为45℃。Na+、K+、Li+等一价离子对该酶活性基本无影响,Mg2+对该酶活性有激活作用,Cu2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+对该酶活性有抑制作用,Km为1.12mmo1／L。分别采用对氯汞苯甲酸（PCMB）、乙酰丙酮（BD）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、二巯基苏糖醇（DTT）、琥珀酸酐（SUAN）.N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、碘乙酸（IAc）这七种化学修饰剂,在一定条件下选择性的修饰牛肝碱性磷酸酶的氨基酸侧链,结果表明：DTT.SUAN、NBS、IAc这四种化学修饰剂能显著的抑制牛肝碱性磷酸酶的活力,并且酶活力的降低与修饰剂浓度的成正相关。而DTT、SUAN、NBS、IAc能选择性的修饰蛋白质中的二硫键、ε-氨基、色氨酸残基、组氨酸残基。因此我们认为,ε-氨基、色氨酸残基、组氨酸残基是牛肝碱性磷酸酶活性中心所必需的功能基团,而二硫键对于维持酶活性中心的结构也是必需的。分别采用海藻酸钠、聚乙烯醇-海藻酸钠为载体固定牛肝碱性磷酸酶。对两种载体固定化方法的单因素实验条件进行优化,并进行了正交优化试验。再对两种方法下的固定化酶进行性质研究,通过实验分别测定出两种固定化酶的最适温度、最适酸碱度和储存稳定性。实验结果：通过海藻酸钠固定法的实验条件优化,确定海藻酸钠的最适浓度为1%,海藻酸钠与酶液的最适比例为3：1,氯化钙的最适浓度为0.5%,固定化酶在氯化钙中放置的最适时间为30min。通过海藻酸钠固定法的正交优化试验,确定CA:AKP的最佳水平为3：1,CA浓度最佳水平为2%,氯化钙浓度的最佳水平为0.2%。海藻酸钠固定法的酶回收率最高可以达到80%。海藻酸钠固定化酶的最适温度为45℃,最适pH值为pH9.5,在30天内,固定化酶的剩余酶活力达到了75%.说明海藻酸钠固定化酶在4℃下具有较好的储存稳定性。通过聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的实验条件优化,确定聚乙烯醇的最适浓度为1%,海藻酸钠的最适浓度为1%,聚乙烯醇-海藻酸钠与酶液的最适比例为4：1,氯化钙的最适浓度为0.5%,固定化酶在氯化钙中放置的最适时间为30min。通过聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的正交优化试验,确定PVA浓度的最佳水平为1.5%,氯化钙浓度的最佳水平为0.2%、CA浓度最佳水平为1.5%,PVA-CA:AKP的最佳水平为4：1,聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的酶回收率最高可以达到95.1%。聚乙烯醇-海藻酸钠固定化酶的最适温度为40℃,最适pH值为10.5。在三十天内,固定化酶的剩余酶活力达到了94%.说明PVA-CA固定化酶在4℃下具有良好的储存稳定性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 碱性磷酸酶的性质及功能研究
• 1.2 碱性磷酸酶的分离纯化研究
• 1.3 金属离子及有机物对该酶的影响研究
• 1.4 碱性磷酸酶的检测方法研究
• 1.5 碱性磷酸酶的同工酶研究
• 1.6 碱性磷酸酶的固定化研究
• 第二章 引言
• 2.1 本研究的目的和意义
• 2.2 本研究的主要试验内容
• 第三章 牛肝碱性磷酸酶的分离纯化及性质研究
• 3.1 材料与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果与分析
• 第四章 牛肝碱性磷酸酶的功能基团研究
• 4.1 材料与试剂
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果与分析
• 第五章 牛肝碱性磷酸酶固定化方法的研究
• 5.1 材料与试剂
• 5.2 主要设备
• 5.3 实验方法
• 5.4 实验结果与分析
• 第六章 讨论
• 6.1 牛肝碱性磷酸酶的分离纯化
• 6.2 牛肝碱性磷酸酶的性质研究
• 6.3 部分金属离子对牛肝碱性磷酸酶的影响
• 6.4 牛肝碱性磷酸酶的功能基团研究
• 6.5 牛肝碱性磷酸酶固定化方法的研究
• 6.6 展望
• 参考文献
• 致谢