藤茶PAL特性及其与黄酮和DMY含量变化相关性的研究

论文摘要

苯丙氨酸解氨酶（PAL）主要催化由苯丙氨酸（Phe）到各种酚类物质,为多种酚类及类黄酮终产物提供前体,是酚类物质代谢的关键酶。本文在优化藤茶PAL粗酶提取和活性检测条件的基础上,对藤茶PAL的分离纯化和相关酶学性质进行了研究,并比较分析了江西、湖南、恩施来源的1芽1叶,3、4叶和茎在不同时期PAL的活性与黄酮和二氢杨梅素（DMY）含量变化的相关性,为今后深入研究藤茶黄酮和DMY形成机理提供理论依据。1.藤茶PAL提取和活性分析条件的优化以L-苯丙氨酸（L-Phe）为底物,对藤茶PAL粗酶提取和活性分析条件进行了研究。结果表明,聚乙烯吡咯烷酮（PVP）加入量对酶活性影响较大。随着PVP加入量的增大,酶活性呈现上升趋势,当加入量为叶量2倍时,酶活性达到最高。缓冲液pH值对酶活性也有较大影响。随着pH值的增大,酶活性先增后减,在pH8.0-pH8.8时,活性增加缓慢,pH8.8时酶活性达到最大值。酶促反应以55℃为宜,在此条件下反应120分钟内酶活性稳定性较好。据此,PAL提取条件为:加入2倍鲜叶量的PVP,以pH8.8的硼酸-硼砂作为提取缓冲液;PAL活性分析条件为:酶促反应温度为55℃,反应时间为120分钟内。2.藤茶PAL的分离纯化采用硫酸铵分级沉淀法和DEAE-纤维素柱层析法对藤茶叶PAL进行分离纯化,经SDS-PAGE电泳检测得到一条单一蛋白的弱带,该酶的纯化倍数提高了8.6倍,得率为6.8%,酶比活为11.8U*102mg-1。3.藤茶PAL酶学性质研究PAL酶学性质研究表明,该酶最适pH为8.8,在pH8.0-pH9.0间比较稳定,酶活性在90%以上。最适温度为55℃,热稳定范围在30℃-60℃之间。在4℃和甘油条件下贮藏两周,酶活性仍在60%。最适底物浓度为0.02mol/L。PAL可能是由35KD的4个亚基组成;对底物的米氏常数:Km1=1.9×10-2,Km2=0.966×10-3。重金属SrCl2、AgNO3都能不同程度地抑制酶活性;金属离子MgCl2,CaCl2、ZnSO4对藤茶PAL有不同程度的抑制作用,而FeSO4,CuSO4,MnCl2（2mmol/L）均促进酶活性;0.5mmol/LEDTA抑制酶活性,而在1mmol/L-4mmol/L范围内对酶活表现为一定的促进作用,SDS对酶活表现出很强抑制作用。4.藤茶不同时期和部位PAL活性与黄酮和DMY含量变化的相关性分析PAL活性与黄酮,DMY含量变化在年生长周期内整体上成负相关性,但是在不同时期和不同部位,有的成正相关,有的则成负相关,而且相关性程度也有很大区别。因此PAL活性并不简单地与特定次生代谢产物呈正相关,而是在不同的阶段以不同的代谢途径为主。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1 藤茶研究进展
• 1.1 藤茶的植物学形态
• 1.2 藤茶的分布与生长生态条件
• 1.3 藤茶基本化学成分
• 1.4 二氢杨梅素的研究
• 2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）研究进展
• 2.1 PAL的存在和分布
• 2.2 PAL的分离纯化
• 2.3 PAL的理化性质
• 2.4 PAL对植物生理代谢的意义
• 2.4.1 在细胞分化和木质化中的作用
• 2.4.2 在植物色素形成过程中的作用
• 2.4.3 在植物的根瘤形成过程中的作用
• 2.4.4 PAL在植物抗病、抗逆境中的作用
• 2.5 PAL的调控方式
• 2.6 PAL的研究展望
• 3 课题研究的内容及意义
• 3.1 本课题研究的主要内容
• 3.2 本课题研究的目的和意义
• 第二章 PAL提取检测和分离纯化条件的选择
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 层析材料
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 主要设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 PAL粗酶液提取条件的优化
• 1.2.2 PAL活性测定条件的优化
• 1.2.2.1 PAL活性测定原理和方法
• 1.2.2.2 加入酶液量的选择
• 1.2.2.3 反应时间和温度的选择
• 1.2.2.4 底物浓度的选择
• 1.2.3 PAL的分离纯化及纯度鉴定
• 1.2.3.1 PAL的盐析和脱盐浓缩
• 1.2.3.2 DEAE-纤维素柱层析
• 1.2.3.3 PAL的纯度鉴定
• 1.2.4 PAL酶活性计算方法
• 1.2.5 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 PAL提取条件的优化
• 2.1.1 PVP加入量的选择
• 2.1.2 硼酸-硼砂缓冲液pH值的选择
• 2.2 PAL活性分析条件的优化
• 2.2.1 加入酶液量的选择
• 2.2.2 反应时间和温度的选择
• 2.2.3 底物浓度的选择
• 2.3 PAL的分离纯化及纯度检测
• 2.3.1 PAL盐析离子浓度的选择
• 2.3.2 DEAE-纤维素柱洗脱pH的选择
• 2.3.3 DEAE-纤维素柱洗脱离子强度的选择
• 2.3.4 DEAE-纤维素柱层析
• 2.3.5 SDS-PAGE电泳纯度检测
• 2.3.6 纯化方案评价
• 3 讨论
• 3.1 关于酶的提取条件
• 3.2 关于酶的检测条件
• 3.3 关于酶的分离纯化
• 4 结论
• 第三章 藤茶PAL酶学性质的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 主要设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 温度对酶活性的影响
• 1.2.2 酶的热稳定性
• 1.2.3 pH对酶活力的影响
• 1.2.4 pH稳定曲线
• 1.2.5 金属离子和某些抑制剂对酶活影响
• 1.2.6 酶的保存稳定性
• 1.2.7 酶水解动力学常数
• 1.2.8 相对分子量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 温度对酶活性的影响
• 2.2 酶的热稳定性研究
• 2.3 pH对酶活性的影响
• 2.4 酶的pH稳定性
• 2.5 酶水解动力学常数的测定
• 2.6 金属离子和某些抑制剂对酶活性的影响
• 2.6.1 活性中心常见金属离子对酶活性的影响
• 2.6.2 重金属离子对酶活性影响
• 2.6.3 金属鳌和剂EDTA及酶变性剂SDS对酶活影响
• 2.7 酶的保存稳定性
• 2.8 分子量的的测定
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 藤茶PAL与黄酮,DMY相关性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 藤茶中黄酮及DMY的提取
• 1.2.2 测定方法
• 1.2.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 藤茶1芽1叶PAL酶活与黄酮,DMY含量变化的相关分析
• 2.2 藤茶3,4叶PAL酶活与黄酮,DMY含量变化的相关分析
• 2.3 藤茶茎PAL酶活与黄酮,DMY含量变化的相关分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢