论文摘要
骨髓基质细胞与bcl-2基因联合治疗脑缺血大鼠疗效以及对IGF-1表达影响的研究前言缺血性脑血管病越来越严重地威胁着人类的健康和生命，但仍缺乏有效治疗手段。因此，如何改善脑梗死后的神经功能恢复是当前神经病学领域的一个研究重点。MSCs具有多向分化潜能，移植后的MSCs在受体脑内可分化为神经细胞和神经胶质细胞。MSCs移植可促进卒中大鼠的神经功能恢复，其疗效与所移植的细胞数量有关。然而MSCs移植后的存活率很低，因此找到提高MSCs脑内存活率的方法是增加MSCs治疗脑缺血疗效的关键。bcl-2基因是第一个被发现的具有抗凋亡作用的基因，并且应用bcl-2基因治疗大鼠局灶性脑缺血可以改善大鼠神经功能。根据以上两点，联合应用bcl-2基因可能会对MSCs移植产生协同作用，提高MSCs治疗脑缺血的疗效。本实验的目的就是探讨联合应用MSCs和bcl-2基因来治疗大鼠局灶性脑缺血，能否促进大鼠神经功能恢复，抑制移植后MSCs的凋亡，增加MSCs治疗脑缺血的疗效，同时检测具有神经保护作用的IGF-1的表达是否增加，从而为脑梗死的治疗开辟一条新途径。实验方法40只Wistar大鼠采用改良线栓法制成大脑中动脉闭塞模型，两小时后再灌注。随机分成4组：空白对照组、bcl-2组、MSCs组和MSCs+bcl-2组，每组再分为3d、14d两个时间点，每一时间点均为5只大鼠。bcl-2组及MSCs+bcl-2组在大鼠脑缺血再灌注3小时后，经颈动脉注入pLXSN-bcl-2质粒；MSCs组及MSCs+bcl-2组在大鼠脑缺血再灌注24小时后，经尾静脉植入MSCs。各组于再灌注后1d、3d、7d及14d进行神经功能评分；于3d及14d分别处死5只大鼠，采用免疫组化法检测BrdU、IGF-1及Bcl-2蛋白的表达；通过TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果判定：每个标本取两张切片，分别在高倍镜（400×）下随机观察额顶叶及纹状体区不重叠的5个视野，显微图像分析系统采集图像，分析阳性细胞面积百分比或计数阳性细胞数。统计学处理：采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析及t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。实验结果1、质粒pLXSN-bcl-2的鉴定：经EcoR I，Xho I双酶切的pLXSN-bcl-2有两条带，一条是850 bp的bcl-2片断，另一条是5863 bp的pLXSN开环片断。2、神经功能评分：再灌注7d、14d后各治疗组神经功能评分明显低于空白对照组（P＜0.05），而14d时MSCs+bcl-2组神经功能评分明显低于bcl-2组及MSCs组（P＜0.05）；3、BrdU免疫组化染色：再灌注后3d、14d，空白对照组和bcl-2组未见BrdU阳性细胞，MSCs组和MSCs+bcl-2组在缺血半球有大量BrdU阳性细胞，其中MSCs+bcl-2组BrdU阳性细胞明显多于MSCs组（P＜0.05）；4、IGF-1免疫组织化学染色：再灌注后3d、14d，治疗组的缺血侧皮质表达IGF-1的细胞较空白对照组明显增多（P＜0.05），其中MSCs+bcl-2组更明显多于bcl-2组及MSCs组（P＜0.05）；5、bcl-2免疫组织化学染色：再灌注后3d、14d，治疗组的缺血侧皮质表达Bcl-2的细胞较空白对照组明显增多（P＜0.05），MSCs+bcl-2组Bcl-2阳性细胞较bcl-2组及MSCs组明显增多（P＜0.05）；6、TUNEL细胞凋亡染色：再灌注后3d、14d，空白对照组大鼠缺血侧可见许多凋亡细胞，明显多于治疗组（P＜0.05），而MSCs+bcl-2组凋亡细胞明显少于bcl-2组及MSCs组（P＜0.05）。结论1、bcl-2基因可抑制MSCs移植后的凋亡，增加其治疗脑缺血的疗效，二者联合应用可产生叠加效应；2、增加IGF-1的表达可能是MSCs治疗脑缺血的机制之一。