穿山龙总皂苷对CIA大鼠关节滑膜血管新生相关因子及其受体的影响

论文摘要

目的：类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是常见、多发的自身免疫性疾病,病变主要侵犯关节滑膜,表现为多发性、进行性的滑膜炎,病理特征为滑膜细胞增生、血管新生增多、血管翳形成等。近年研究表明血管新生和血管翳的形成在RA的发生发展中具有非常重要的作用,抑制血管新生可能是治疗RA的一个新靶点。前期研究已经表明穿山龙总皂苷灌胃给药可以缓解大鼠关节肿胀等炎症反应,减轻滑膜炎性细胞浸润和滑膜组织增生等病理改变；可以抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子。本研究目的是在前期工作的基础上,以胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）大鼠为模型,探讨穿山龙总皂苷对血管新生相关因子血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）及其受体Flk-1,血管生成素2（angiopoietin-2, Ang-2）及其受体Tie-2等的影响,为进一步阐明穿山龙治疗RA的作用机制提供实验依据,为使其开发成一种新的治疗RA制剂奠定基础。方法：1清洁级雌性Wistar大鼠65只,随机分为5组：正常对照组、CIA模型组、穿山龙总皂苷组（25mg/kg/d）、雷公藤对照组（12mg/kg/d）和薯蓣皂苷元组（50mg/kg/d,25mg/kg/d）,每组12只。除正常组外,其余组大鼠均建立CIA大鼠模型,待于模型成功建立后,分别给予相应的药物灌胃21d,正常对照组、CIA模型组灌服等体积溶媒（0.5%CMC）1.1取血后处死大鼠,各组分别取膝关节滑膜（薯蓣皂苷元组取用药剂量为50mg/kg/d的大鼠）采用免疫组织化学染色观察滑膜微血管密度（micro-vessel density, MVD）,和VEGF、Flk-1、Ang-2及Tie-2的表达水平。采用MiVnt图像分析系统对结果进行定量分析。1.2取血后处死大鼠,各组分别取膝关节滑膜（薯蓣皂苷元组取用药剂量为25mg/kg/d的大鼠）,Trizol提取滑膜总RNA,逆转录cDNA,采用PrimeScriptTM实时荧光定量PCR试剂盒检测各组滑膜组织VEGFmRNA的表达水平。2采用SPSS11.5软件包进行统计分析。所有数据以均数±标准差（x士s）表示,组间比较用单因素方差分析,组间两两比较用q检验,以a=0.01作为显著性检验标准。结果：1一般状态大鼠初次免疫注射后,背部及尾根部形成多处小溃疡,第12d后,后足部出现明显肿胀,发红；以后逐渐累及后肢膝关节及前肢。CIA模型组大鼠进食减少,精神萎靡,四肢关节持续肿胀,随着病情发展足爪出现畸形,行动不便。经相应药物治疗后,穿山龙总皂苷组、雷公藤对照组、薯蓣皂苷元组大鼠与CIA模型组大鼠相比,上述症状均有不同程度减轻。正常组大鼠在整个实验期间饮食正常,精神状态好,被毛有光泽,四肢关节无明显变化。2各组大鼠膝关节滑膜微血管密度（MVD）CIA模型大鼠滑膜组织血管丰富,新生血管数量较多且密集,MVD（9.20±1.30）条明显大于空白对照组（3.00±0.71）条（P<0.01）。与CIA组大鼠相比,穿山龙总皂苷组、雷公藤对照组、薯蓣皂苷元组大鼠的MVD分别为（4.80±0.45、5.00±0.82、5.20±0.84）条均明显降低（P<0.01）,各治疗组间比较无明显差异（P>0.05）。3各组大鼠膝关节滑膜VEGF蛋白的表达VEGF免疫组化阳性产物为黄色或棕黄色颗粒,位于细胞浆。与空白对照组相比,CIA模型组大鼠滑膜VEGF的表达明显升高（P<0.01）。与CIA模型组相比,穿山龙总皂苷组、雷公藤对照组、薯蓣皂苷元组大鼠滑膜VEGF的表达明显降低（P<0.01）,各治疗组间比较无明显差异（P＞0.05）。4各组大鼠膝关节滑膜Flk-1蛋白的表达Flk-1免疫组化阳性产物为黄色或棕黄色颗粒,位于细胞浆或细胞膜。与空白对照组相比,CIA模型组大鼠滑膜Flk-1的表达明显升高（P<0.01）。与CIA模型组相比,穿山龙总皂苷组、雷公藤对照组、薯蓣皂苷元组大鼠滑膜Flk-1的表达明显降低（P<0.01）,各治疗组间比较无明显差异（P>0.05）。5各组大鼠膝关节滑膜Ang-2蛋白的表达Ang-2免疫组化阳性产物为黄色或棕黄色颗粒,位于细胞浆,少量表达于细胞核。与空白对照组相比,CIA模型组大鼠滑膜Ang-2的表达明显升高（P<0.01）。与CIA模型组相比,穿山龙总皂苷组、雷公藤对照组、薯蓣皂苷元组大鼠滑膜Ang-2的表达明显降低（P<0.01）,各治疗组间比较无明显差异（P>0.05）。6各组大鼠膝关节滑膜Tie-2蛋白的表达Tie-2免疫组化阳性产物为黄色或棕黄色颗粒,位于细胞浆或细胞膜。与空白对照组相比,CIA模型组大鼠滑膜Tie-2的表达明显升高（P<0.01）。与CIA模型组相比,穿山龙总皂苷组、雷公藤对照组、薯蓣皂苷元组大鼠关节滑膜Tie-2的表达呈降低趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）,各治疗组间比较无明显差异（P>0.05）。7实时荧光定量PCR检测大鼠膝关节滑膜VEGFmRNA的表达水平与空白对照组VEGF目的基因表达量（0.736±0.162）比较,CIA模型组VEGF目的基因表达量（1.056±0.342）明显升高（P<0.01）；与CIA模型组比较,穿山龙总皂苷组VEGF目的基因表达量（0.433±0.233）、雷公藤对照组VEGF目的基因表达量（0.711±0.160）和薯蓣皂苷元组VEGF目的基因表达量（0.750±0.199）明显降低（P<0.01）；与薯蓣皂苷元组与雷公藤对照组VEGF目的基因表达量比较,穿山龙总皂苷组VEGF目的基因表达量降低（P<0.05）。结论：1CIA模型大鼠膝关节滑膜血管新生增多,细胞因子VEGF及其受体Flk-1、Ang-2及其受体Tie-2表达升高。2穿山龙总皂苷可以减少CIA大鼠膝关节滑膜新生血管数量。3穿山龙总皂苷能明显降低CIA大鼠膝关节滑膜VEGF及其受体Flk-1、Ang-2及其受体Tie-2、VEGFmRNA的表达水平,表明抑制上述细胞因子和受体的表达是其抑制血管新生的原因之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历