长期定位施肥棕壤及西藏高原土土壤微生物特性研究

论文摘要

本文以沈阳农业大学长期地膜覆盖定位实验站不同施肥处理（不施任何肥料（CK）、单施氮肥（N）、单施有机肥（M）以及有机肥和氮肥配施（M+N））下的棕壤和西藏高原地区不同海拔高度的13种土壤为试验材料,测定了土壤的基本理化性质,运用变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）对土壤细菌的多样性进行了研究,并结合实时定量PCR（Real-Time PCR）技术对土壤中细菌、真菌、氨氧化古菌（Ammonia oxidizing archaea,AOA）和氨氧化细菌（Ammonia oxidizing bacteria, AOB）等不同微生物菌群进行了定量分析。结果表明：沈阳长期施肥试验中,施加氮肥的土壤pH为4.9,低于其它三个处理；而在有机肥（M）和有机-无机配施（M+N）处理中,土壤N,P和K的含量均高于对照处理。采用DGGE对土壤细菌进行多样性分析后发现,酸杆菌是土壤中的优势菌群；施加有机肥（M和M+N）的土壤细菌种类丰富,且出现芽孢杆菌；氮肥处理土壤的细菌多样性最低,却在该处理中检测到了放线菌。定量结果显示,土壤样品中各微生物之间的数量关系为：细菌>真菌>AOB>AOA;在氮肥处理中,四种微生物数量均为最低。西藏高原地区不同海拔高度的13种土壤呈碱性,pH都在8.5以上；高海拔地区土壤有机质和全氮含量明显低于低海拔地区。DGGE结果显示,蓝藻菌是土壤中的优势菌群,高海拔土壤都含有芽单胞菌,而放线菌则大都在低海拔土壤中才检测得到。由Real-TimePCR分析发现,随着海拔的升高,土壤中的微生物数量在减少；另外,较低海拔时AOA数量高于AOB,而海拔升高后情况相反。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 土壤微生物研究进展
• 1.2.1 土壤微生物在生态系统中的作用
• 1.2.2 土壤微生物多样性研究进展
• 1.2.3 土壤微生物多样性与土壤性质和功能的关系
• 1.3 土壤微生物群落多样性研究方法
• 1.3.1 经典的微生物纯培养法
• 1.3.2 生物标志物法
• 1.3.3 Biolog微平板法
• 1.3.4 分子生物学方法
• 1.3.4.1 土壤微生物总DNA的提取
• 1.3.4.2 随机扩增多态DNA分析
• 1.3.4.3 限制片段长度多态性分析
• 1.3.4.4 单链构象多态性分析
• 1.3.4.5 变性梯度凝胶电泳
• 1.3.4.6 实时荧光定量PCR
• 1.4 本课题的研究内容
• 第2章 材料和方法
• 2.1 供试土壤
• 2.1.1 沈阳棕壤
• 2.1.2 西藏高原土
• 2.2 土壤基本理化性质测定方法
• 2.3 土壤细菌群落结构分析方法
• 2.3.1 仪器及试剂
• 2.3.2 土壤总DNA的提取
• 2.3.3 细菌16S rDNA PCR
• 2.3.4 DGGE
• 2.3.4.1 变性剂储存液的配制
• 2.3.4.2 电泳变性胶的配制
• 2.3.4.3 电泳变性胶的灌制
• 2.3.4.4 V3区的DGGE分离
• 2.3.4.5 染色
• 2.3.4.6 特征条带的回收
• 2.3.5 特征条带的纯化
• 2.3.6 克隆
• 2.3.6.1 装载体
• 2.3.6.2 转化
• 2.3.6.3 挑克隆及重组子的检测
• 2.3.6.4 目的DNA序列的测定
• 2.3.7 数据处理
• 2.4 土壤微生物定量分析
• 2.4.1 引物与探针
• 2.4.2 反应体系
• 2.4.3 扩增程序
• 2.4.4 标准曲线的制作
• 第3章 沈阳棕壤实验结果与分析
• 3.1 土壤基本理化性质
• 3.2 细菌16S rDNA片段扩增
• 3.3 细菌DGGE
• 3.3.1 DGGE图谱分析
• 3.3.2 DGGE谱带戴斯系数
• 3.3.3 DGGE谱带聚类分析
• 3.3.4 系统发育树
• 3.4 沈阳棕壤微生物定量结果分析
• 3.5 小结
• 第4章 西藏高原土实验结果与分析
• 4.1 土壤基本理化性质
• 4.2 细菌16S rDNA片段扩增
• 4.3 细菌DGGE
• 4.3.1 DGGE图谱分析
• 4.3.2 DGGE谱带戴斯系数
• 4.3.3 DGGE谱带聚类分析
• 4.3.4 系统发育树
• 4.4 西藏高原土微生物定量结果分析
• 4.5 小结
• 第5章 结论与讨论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 土壤微生物核糖体DNA PCR扩增
• 5.1.3 DGGE方法
• 5.1.3.1 DGGE凝胶的制备
• 5.1.3.2 DGGE电泳过程
• 5.1.4 DGGE结果
• 5.1.5 克隆条带的选择
• 5.1.6 Real-Time PCR
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢