混菌发酵中克鲁维酵母衰亡原因及其对酒风味的影响

论文摘要

在葡萄酒的酿造中主要存在两种发酵方式，一种是纯种发酵，指整个发酵过程是由单一的菌种来完成的，另一种被称为混菌发酵，指整个发酵过程是由两种或两种以上的菌种共同作用完成。两种发酵方式各有各的优点，纯种发酵过程操作相对简单，便于机械化、自动化生产，而且成品葡萄酒的质量比较稳定，但风味相对于混菌发酵较差。而混菌发酵由于是在几种微生物的共同作用下完成的，不同的微生物之间存在着相互作用，在工业生产中比较难控制，但混菌发酵中不同的微生物在不同发酵时期的产物能满足葡萄酒风味多样化的需求，这也是葡萄酒具有区域特色的原因。基于上述两种发酵形式结合混菌发酵的优点，本实验选择葡萄皮表面常见的两种菌；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae FCC2144），克鲁维酵母（Kluyveromycesthermotolerans FCC2116）,主要研究以下内容：（1）两种菌混合发酵时酿酒酵母和非酿酒酵母生长的变化情况。（2）在两种菌生长变化已知的条件下，分别对酿酒酵母胞外蛋白和非酿酒酵母胞内蛋白进行双向电泳解析，找到酵母菌衰亡的内部和外部原因。（3）最后，在上述问题搞清楚的前提下，考察混菌发酵中微生物生长的变化对葡萄酒最终风味的影响。本研究采用透析袋发酵法实现对单一菌种生长状况的研究，并采用基质辅助飞行时间质谱技术对非酿酒酵母胞内蛋白进行了解析，实验表明：在葡萄酒的混菌发酵过程中，非酿酒酵母的生长与纯培养相比产生较大变化，纯培养中非酿酒酵母存在于整个发酵过程中，而在完全混合式发酵和不同截流分子量的透析袋发酵中非酿酒酵母的生存时间大大缩短，即出现提前死亡现象。通过阻断两种酵母细胞之间物质的交换可以从一定程度上缓解细胞之间的抑制作用。为找到混菌发酵中非酿酒酵母出现提前死亡的原因，本实验对酿酒酵母的胞外蛋白以及非酿酒酵母的胞内蛋白进行了解析，研究表明：酿酒酵母在纯培养过程中分泌的一些蛋白质类物质会对克鲁维酵母的衰亡产生诱导作用，而且克鲁维酵母的存在会诱导酿酒酵母分泌一些特异性蛋白类物质。结合MALDI-TOF/MS等技术对不同发酵条件下克鲁维酵母胞内蛋白进行解析，表明酿酒酵母分泌的代谢产物导致非酿酒酵母体内一些与能量代谢、遗传物质复制与修复、一些保护物质合成与运输等有关蛋白表达发生变化导致非酿酒酵母的提前衰亡。混菌发酵与纯种发酵相比，挥发酸（0.22<0.46g/L）、乙醛（30.61<82.50mg/L）和乙偶姻（5.62<14.33mg/L）的产量降低，发酵中能够明显提高酒滴定酸度、降低酒挥发酸度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 葡萄酒发酵
• 1.1.1 葡萄酒相关酵母的定义
• 1.1.2 葡萄酒相关酵母的来源
• 1.1.3 葡萄酒发酵过程中酵母种类的变化及作用
• 1.1.3.1 葡萄酒发酵过程中酵母种类的变化
• 1.1.3.2 葡萄酒相关酵母菌在生产中的主要作用
• 1.1.4 两种发酵方式：纯种发酵与自然发酵
• 1.1.5 葡萄酒主要风味物质
• 1.1.5.1 乙醛
• 1.1.5.2 高级醇
• 1.1.5.3 酯类
• 1.1.5.4 风味有机酸
• 1.2 蛋白质组学概述
• 1.2.1 蛋白质组学简介
• 1.2.2 蛋白质分离技术
• 1.2.3 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳及应用
• 1.2.4 质谱技术
• 1.2.5 凝胶图像分析与蛋白质数据库
• 1.3 本课题的研究工作
• 1.3.1 本课题的研究意义
• 1.3.2 本课题的研究内容
• 第二章 混菌发酵微生物生长变化
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 菌种
• 2.1.1.2 实验试剂
• 2.1.1.3 试验仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 培养基
• 2.1.2.2 混菌发酵生长曲线的测定方法
• 2.1.2.3 残糖的测定方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 混菌发酵过程中酿酒酵母生长的变化
• 2.3 本章小结
• 第三章 混菌发酵中非酿酒酵母提前死亡的外部原因
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 菌种
• 3.1.1.2 实验试剂
• 3.1.1.3 试验仪器
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 发酵培养基
• 3.1.2.2 残糖的测定方法
• 3.1.2.3 酒精浓度的测定
• 3.1.2.4 发酵方法
• 3.1.2.5 双向电泳
• 3.1.2.6 用以戊二醛为增敏剂的银染方法
• 3.1.2.7 凝胶图像的分析
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 外界条件对非酿酒酵母生长的影响
• 3.2.2 不同发酵条件下生长曲线
• 3.2.3 发酵上清液胞外蛋白解析
• 3.3 本章小结
• 第四章 混菌发酵中非酿酒酵母提前死亡的内部原因
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 菌种
• 4.1.1.2 实验试剂
• 4.1.1.3 试验仪器
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 菌种培养方法
• 4.1.2.2 菌体细胞总蛋白的制备
• 4.1.2.3 蛋白质双向电泳解析
• 4.1.2.4 能与质谱兼容的银染步骤
• 4.1.2.5 凝胶图像的分析
• 4.1.2.6 酶解方法
• 4.1.2.7 肽段提取方法
• 4.2 实验结果
• 4.3 本章小结
• 第五章 混菌发酵与纯种发酵相比风味的变化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.1.1 菌种
• 5.1.1.2 实验试剂
• 5.1.1.3 试验仪器
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 液相色谱样品的制作
• 5.1.2.2 气相色谱样品的制作
• 5.1.2.3 高效液相色谱操作条件
• 5.1.2.4 气相色谱条件
• 5.1.2.5 甘油的测定方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.3 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 硕士期间参与的科研项目及成果
• 致谢