广谱乳酸菌素产生菌的筛选及其发酵研究

论文摘要

随着经济与社会的不断发展,人们的生活水平在日益提高,从而对绿色食品、健康食品有了新的认识。现阶段绝大部分食品中添加的都是合成防腐剂,存在着安全隐患,然而乳酸菌素作为一种天然防腐剂正好迎合了人们的需要。乳酸菌素是一类由乳酸菌在代谢过程中产生的抑菌蛋白、多肽或前体多肽,主要用于抑制食品中腐败菌和致病菌的繁殖与生长。目前国内应用最广泛的Nisin只能抑制食品中革兰氏阳性细菌的生长,而不能抑制革兰氏阴性细菌,因此筛选能够抑制革兰氏阳性、阴性两类细菌的新菌株显得尤为重要。本实验以安徽大学龙河校区农贸市场零售的发酵食品（豆角汁、黄瓜汁、醪糟汁、腐乳、豆瓣酱和泡菜汁）为原材料。首先通过脱脂乳培养基进行富集培养,然后用无菌水作梯度稀释,涂布,挑取单菌落,连续划线3次予以纯化并保存；对纯化菌株进行革兰氏染色、乳酸纸层析筛选出产乳酸的革兰氏阳性菌,同时进行试管斜面保存；最后以大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtills）、金黄色葡萄球菌（Stapylococcus aureus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、青霉（Penicillium）和黑曲霉（Aspergillus niger）六种菌作为指示菌,采用牛津杯双层琼脂扩散法检测筛选菌株的抑菌谱大小,并经过有机酸排除、过氧化氢排除等试验,最终确定了来自黄瓜汁中的一株抑菌效果好、抑菌谱广的乳酸菌,本文命名为H1菌株。实验中通过革兰氏染色、电镜拍照、传统的生理生化试验及16SrDNA分子水平的鉴定,确认所筛菌株H1为乳杆菌属（Lactobacillus）中的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum JDM1）。随后实验以筛选并鉴定的H1菌株为出发菌株,进行500 mL三角瓶发酵研究,在此基础上,本实验以10 L小型机械搅拌式发酵罐为反应器,进行发酵动力学的研究。主要是测定菌体浓度（干重法）、葡萄糖含量（DNS法）和抑菌圈直径的大小（牛津杯双层琼脂扩散法）等随时间的变化。利用Luedeking-Piret方程和Logistic equation来描述各个指标的变化,并进行曲线拟合,最终成功构建了菌体生长、基质消耗和产物合成随时间变化的动力学数学模型。本实验最后对海藻酸钠包埋植物乳杆菌的制备及其发酵进行了初步研究。优化得到固定化的最佳工艺条件为：海藻酸钠浓度为3.0%,CaCl2浓度为1.5%,离心后菌稀释比为1：5。外部因素对固定化细胞发酵的影响表明：发酵液最适pH为7.0,发酵培养最佳温度为36℃,培养基中添加0.1%的吐温80时,发酵液抑菌圈直径达最大,NaCl含量的多少对固定化细胞的发酵影响很大,应严格控制NaCl的浓度。固定化细胞的热稳定性研究结果显示,其热稳定性明显提高,连续发酵多批次效果良好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.1.1 生物防腐剂的发展
• 1.1.2 乳酸菌的开发及应用
• 1.1.3 乳酸链球菌素（Nisin）
• 1.1.4 乳酸菌素的种类及抑菌机理
• 1.1.5 乳酸菌素的应用
• 1.1.6 乳酸菌素的研究现状及展望
• 1.2 本课题的研究意义及内容
• 1.2.1 课题的研究意义
• 1.2.2 课题的研究内容及技术路线
• 第二章 广谱乳酸菌素产生菌的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 乳酸菌的筛选结果
• 2.2.2 广谱乳酸菌素产生菌的初筛结果
• 2.2.3 广谱乳酸菌素产生菌的复筛结果
• 2.3 小结
• 第三章 广谱乳酸菌素产生菌的鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 形态学观察
• 3.2.2 传统的生理生化试验
• 3.2.3 16SrDNA的分子鉴定
• 3.3 小结
• 第四章 广谱乳酸菌素产生菌发酵动力学的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 广谱乳酸菌素产生菌的发酵代谢过程
• 4.2.2 菌体生长动力学
• 4.2.3 产物生成动力学
• 4.2.4 葡萄糖消耗动力学
• 4.3 小结
• 第五章 广谱乳酸菌素产生菌固定化的初步研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 海藻酸钠（SA）固定化细胞小球的制备
• 5.2.2 菌体固定化影响因素的优化
• 5.2.3 固定化胶珠的重复发酵
• 5.2.4 固定化胶珠含菌量的测定
• 5.2.5 不同直径胶珠对发酵的影响
• 5.2.6 固定化菌与游离菌的发酵特性比较
• 5.2.7 外部因素对固定化细胞小球发酵的影响
• 5.2.8 保存不同时间后固定化胶珠耐热性状况
• 5.3 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 致谢