论文摘要
大量实验和临床研究发现应激可以导致免疫功能的改变。外科手术作为一种临床常见的诊疗手段,在治疗疾病的同时由于手术造成的创伤,不可避免地影响了免疫系统的功能。创伤应激可以引起机体免疫功能受抑制,导致机体抗病能力下降,免疫抑制状态持续的时间越长,并发感染的机会就越多,严重时甚至威胁生命。如何提高机体的免疫功能、增强抗病能力是人们普遍关心的一个问题。针刺疗法经过长期的临床实践检验已确认其对某些疾病的确有效,针刺治病并非直接作用于致病因子或病变组织,其治疗的途径之一在于通过重建免疫系统的稳定性,以使疾病趋于康复。中医理论认为“正气存内,邪不可干；邪之所凑,其气必虚”。中医所认为的虚证与现代医学所认为的免疫力低下、免疫抑制非常相似。研究表明,正气虚则细胞免疫功能低下、非特异性免疫功能降低。大量的临床与基础研究证实,针刺对机体的免疫系统具有调节作用。本实验室以往的研究也同样证明,电针疗法可以改善创伤应激后大鼠的免疫抑制,然而其机制仍然有待进一步阐明。细胞外信号调节激酶(extracellular signal—regulated kinase, ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)的家族成员之一,ERK广泛存在于中枢神经系统,可对多种细胞外刺激发生反应,是将哺乳动物细胞外信号转导至胞内并激活一系列级联反应的关键物质。在中枢神经系统中目前研究发现ERK可通过调节基因表达、蛋白合成等影响神经细胞增殖分化、突触可塑性、轴突生长等,并且参与多种神经系统疾病的病理生理过程。本实验室前期研究表明,磷酸化ERK1/2在大鼠创伤应激后在大脑皮层表达发生了变化,ERK1/2抑制剂能拮抗创伤应激后的免疫抑制,提示ERK1/2可能参与创伤应激大鼠的免疫抑制。ERK5是MAPK信号转导通路中相对较新的一条通路,可以被各种刺激因素激活,包括一些有丝分裂原(例如EGF)和一些细胞应激(例如氧化作用)等。在成年小鼠中,ERK5及其上游激酶MEK5在脑及免疫器官(如胸腺、脾)中高表达。然而,中枢ERK5在创伤应激后是否发生变化?ERK5信号转导通路是否参与创伤应激后免疫抑制及电针的调节作等仍属未知。本研究工作将主要探讨ERK1/2和ERK5通路在电针“足三里”穴改善创伤应激大鼠免疫功能中的作用及机制。一、大鼠创伤应激后磷酸化ERKI/2与磷酸化ERK5的表达变化以及电针对其的影响经免疫组织化学法显示,大鼠创伤应激24h后,磷酸化ERK1/2与磷酸化ERK5的表达发生了变化,主要在大脑皮层部位出现高表达。创伤手术后立即给予模型大鼠电针双侧“足三里”穴,持续30min,能显著降低手术后24小时大脑皮层磷酸化ERK1/2与磷酸化ERK5的表达。结果提示创伤应激作为一种外在刺激因素激活了ERK1/2与ERK5信号转导通路,使其磷酸化增加。而电针双侧“足三里”穴可以降低磷酸化ERK1/2与磷酸化ERK5的表达。二、电针以及ERK5抑制剂BIX02188对大鼠创伤应激后磷酸化ERK5与磷酸化ERK1/2表达变化的影响Western blot结果显示,大鼠创伤应激后24h大脑皮层磷酸化ERK5水平显著增加(P<0.05,vs正常对照组),创伤应激后给予模型大鼠电针治疗,能显著降低磷酸化ERK5的表达(P<0.05)。大鼠造模前30min侧脑室注射(icv.) ERK5特异性抑制剂BIX02188(4nmol或20nmol),可阻断磷酸化ERK5的表达(P<0.01,vs溶剂对照组)。ERK5抑制剂BIX02188对磷酸化ERK1/2通路无显著影响。此外,结果显示大鼠创伤应激24h后,磷酸化ERK1/2表达增加,电针组较创伤模型组表达下降,此与免疫组织化学法结果一致。上述结果进一步证实创伤应激24h后磷酸化ERK1/2与磷酸化ERK5表达增加,电针可以降低其表达水平。ERK5抑制剂BIX02188可以特异性抑制ERK5磷酸化,而对ERK1/2磷酸化无影响。三、电针或ERK5抑制剂BIX02188对自然杀伤(NK)细胞活性的影响观察大鼠创伤应激后24h自然杀伤(NK)细胞活性的变化,以及电针和ERK5抑制剂对其影响。创伤后24h大鼠脾脏NK细胞活性降低,给予电针治疗能增强创伤模型组NK细胞活性。大鼠造模前30min icv.ERK5抑制剂BIX02188(4nmol或20nmol),抑制剂组比创伤模型组NK细胞活性增加。结果表明,电针或ERK5抑制剂BIX02188 (4nmol)能改善创伤应激导致的NK细胞活性下降,BIX02188 (20nmol)组NK细胞活性则呈下降趋势。四、电针或ERK5抑制剂BIX02188对脾淋巴细胞增殖反应的影响观察大鼠创伤应激后24h脾淋巴细胞增殖反应的情况,以及电针和ERK5抑制剂对其影响。创伤后24h大鼠脾脏淋巴细胞增殖反应降低。大鼠造模前30min侧脑室注射ERK5抑制剂BIX02188 (4nmol或20nmol),抑制剂组比创伤模型组脾脏淋巴细胞增殖反应增加,电针组则呈现增加的趋势。结果提示,电针或ERK5抑制剂BIX02188 (4nmol或20nmol)能改善创伤应激导致的脾脏淋巴细胞增殖反应降低。小结：(1)创伤应激后24h可引起大鼠大脑皮层磷酸化ERK1/2和磷酸化ERK5表达增加,电针“足三里”穴可以降低其表达水平。(2)ERK5参与创伤应激后的免疫抑制。ERK5抑制剂BIX02188能改善创伤应激介导的免疫抑制。(3)电针可能通过抑制大脑皮层磷酸化ERK5和ERK1/2信号通路改善创伤应激引起的免疫抑制。