论文摘要
青霉素类抗生素是一类高效、低毒的抗生素,但由青霉素类抗生素引起的过敏反应在临床药物引起的过敏反应中,发生率居于首位,严重者甚至可引起过敏性休克乃至死亡病例的出现。血清总IgE或特异性IgE的升高是青霉素过敏反应发生的重要特征。早期对于青霉素类抗生素引起过敏反应的研究认为：其主要是由特异性IgE抗体所介导而引发的Ⅰ型超敏反应,且已研究表明,特异性IgE抗体是介导过敏反应的关键。随着对其研究的深入,认为T细胞在青霉素类抗生素诱发的速发型、迟发型过敏反应中均有重要作用。目前,青霉素类药物过敏反应的预测和诊断主要是采用皮内试验法。该方法简便易行,但缺点在于因病人个体差异、皮试药剂成分不同和结果判断标准的掌握尺度不一等诸多因素的影响,造成假阳性和假阴性率较高；尤其是对于部分高敏患者,在皮试过程即可发生休克甚至死亡。因此,开发青霉素类药物过敏的体外诊断方法日益受到各国科研人员的重视。青霉素过敏和抗青霉素特异性抗体有密切关系,其抗青霉素类抗生素特异性抗体是由B细胞产生,该过程受到不同的T淋巴细胞亚群分泌的多种细胞因子复杂交叉的调控。此外,青霉素过敏也不再仅限于由于IgE介导的Ⅰ型超敏反应,其过敏反应也涉及到其它几种类型的超敏反应的发生,这些超敏反应也受到多种细胞因子的分泌的影响,从而进行着复杂而又交叉的调节和控制。现在随着对免疫相关分子与青霉素过敏关系研究的深入,发现许多因子与过敏性疾病相关。然而,更多的候选基因以及这些候选基因的遗传变异在青霉素过敏反映中的作用还远未被认识。在本研究中选取了IL-12和IL-18细胞因子,它们都是目前研究较为热点的细胞因子,并且它们与临床免疫相关疾病关系密切。本研究以青霉素过敏病人为研究对象,用RAST的方法测定了青霉素过敏病人中针对青霉素类分子主次要抗原决定簇的8种特异性IgE水平,使用ELISA方法测定青霉素过敏病人中血清IL-18和IL-12的水平,PCR-SSP的方法对人群中的IL-12基因和IL-18基因的基因多态性进行了分析,同时从青霉素过敏病人与正常对照间的差异基因表达的结果中挑选出IL-8R,对其在外周血白细胞中表达水平进行了检测。从而与所测得的病人体内的青霉素特异性抗体水平相比较,对IL-12、IL-18以及IL-8R在青霉素类抗生素过敏反应发生中的作用和地位加以讨论,从而为更好的预防、诊断和治疗青霉素过敏提供参考依据。第一部分青霉素过敏反应与特异性IgE抗体相关性分析[目的]评价RAST方法在青霉素类抗生素过敏反应诊断中的可靠性,分析青霉素类抗生素的交叉过敏反应情况；探讨侧链结构在交叉过敏反应中的重要性。[方法]制备抗原决定簇纸片：制备连接青霉素G（PG）、青霉素V（PV）、阿莫西林（AX）和氨苄西林（AMP）四种药物的主、次要抗原决定簇的抗原纸片。PG、PV、AMP、AX的主、次要抗原决定簇分别为：BPO-PLL和BPA-PLL, PVO-PLL和PVA-PLL, APO-PLL和APA-PLL, AXO-PLL和AXA-PLL。选取614例正常对照人群和606例青霉素过敏病人,引起过敏的药物为PG、PV、AMP和AX。使用RAST方法对青霉素过敏病人和正常对照组的以上8种特异性IgE水平,以正常对照组的x±2.33s制定标准值,病人组中高于此上线即定义为IgE阳性。根据病人皮试情况、皮试或用药后出现的过敏症状、出现症状的时间以及病人的年龄性别等进行分组,比较不同组间IgE水平及阳性率情况。[结果]本实验制成的纸片与国外参比纸片无明显差异（P<0.05）;同时使用主次要抗原决定簇特异性IgE抗体的检测较单用主要抗原决定簇时的41.9%检出率,增加至63.7%；BPO-IgE、PVO-IgE、BPA-IgE和PVA-IgE水平随青霉素过敏病人年龄升高有升高的趋势；特异性IgE水平与性别无关；BPO-IgE和BPA-IgE的水平与出现过敏症状病人的皮试结果相关；对青霉素G和青霉素V的IgE水平与用药后出现的呼吸困难症状有关；针对青霉素IgE阳性与皮试阴阳性及皮试后症状有关系；在四种青霉素类药物中,在使用青霉素G后更易发生过敏症状；在使用次要抗原决定簇的病人皮试后是否出现过敏症状无密切相关；青霉素过敏病人体内IgE水平随时间有下降趋势。[结论]本研究中所制备的青霉素类药物抗原纸片,经过验证,其敏感性、特异性和稳定性较好,能较好检出病人血清中IgE水平；同时使用主、次要抗原决定簇特异性IgE抗体的检测,能提高过敏病人的检出阳性率；四种青霉素类药物中青霉素G的IgE抗体阳性与出现过敏症状的青霉素皮试阳性更密切；青霉素过敏病人中,体内特异性IgE水平随时间的延长而降低。第二部分白细胞介素-18及白细胞介素-12与青霉素过敏的关系[目的]测定正常人和青霉素过敏病人中血清IL-18和IL-12的水平,探讨IL-18和IL-12在青霉素类抗生素过敏反应发生中的作用和地位。[方法]依照青霉素过敏的诊断原则,即皮试阳性或皮试阴性但在应用青霉素类药物后出现临床症状的原则选择青霉素过敏病人,以ELISA的方法检测青霉素过敏病人和正常对照人群中血清1L-18和IL-12的水平。[结果]青霉素过敏病人组IL-18和IL-12水平均较正常人组升高（102.8 pg/ml vs 67.9 pg/ml,15.8 ng/ml vs 13.5 ng/ml, P<0.05）;出现休克、呼吸困难、荨麻疹等不同过敏症状青霉素过敏病人中血清IL-18和IL-12水平均较正常人升高,但不同症状间无统计学差异（P>0.05）；皮试或用药后出现症状的青霉素过敏病人中IL-18水平较正常人升高（P<0.05）,但仅皮试阳性而无症状的青霉素过敏病人中IL-18水平与正常人相比无明显变化（P>0.05）；在用药后出现症状的青霉素过敏病人中,皮试阴性者血清IL-12水平较皮试阳性者升高（P<0.05）；在速发型和迟发型过敏病人间血清IL-12和IL-18水平均无明显统计学差异；出现不同特异性IgE抗体阳性种类数的青霉素过敏病人间IL-12和IL-18水平无明显差异；在青霉素过敏病人组和正常人组内,血清IL-12和IL-18水平存在正相关（P<0.05）。[结论]青霉素过敏病人组血清IL-18和IL-12水平均较正常人组升高,且其水平的升高和青霉素过敏的发生相关。青霉素过敏病人是否会出现临床症状与IL-18水平升高有关,皮试情况与IL-12水平相关,但在皮试或用药后出现何种临床症状与IL-12和IL-18水平无关。无论在青霉素过敏病人还是在正常人中,IL-12和IL-18水平存在正相关。第三部分1L-18和IL-12的基因多态性与青霉素过敏的相关性[目的]以PCR-SSP技术检测青霉素过敏病人中IL-18基因和IL-12B基因的基因多态性（SNP）,探讨IL-18和IL-12B基因SNP与青霉素过敏的关系。[方法]选取IL-18基因启动子区的-607A/C和-137G/C位点以及IL-12B启动子区的-6415（CTCTAA/GC）位点和3’非翻译区10841（C/A）位点,依照相应位点的多态性碱基类型设计相应的针对该位点的特异性PCR引物（-607A和-607C,-137G和-137C,-6415C和-6415G,10841C和10841A）,使该引物3’端碱基恰好位于该多态性位点并与其相匹配,同时也设计与该特异性引物相匹配的配对引物（607R、137R,-6415F、10841R）及阳性扩增用对照引物（607F、137F,-6415R、10841F）。提取青霉素过敏病人和正常对照人外周血单个核细胞基因组DNA,以其为模板,选用上述特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增情况,看是否在特定的PCR引物中出现相应的PCR产物。同时选取一定数量的PCR进行测序分析,以验证PCR-SSP的准确性。[结果]1.使用相应位点特异性引物均能扩增出相应大小的PCR产物,但该特异性引物不是该位点匹配碱基时则无PCR产物出现；并且经DNA测序分析,本研究采用的PCR-SSP能准确反映待检DNA中IL-18-607A/C和-137G/C位点以及IL-12启动子区的-6415（CTCTAA/GC）位点和3’非翻译区10841（C/A）位点的多态性情况。2.IL-18-607A/C和-137G/C以及IL-12-6415（CTCTAA/GC）和10841（C/A）四个位点SNP在对照组均符合Hardy-Weinberg平衡分布。3.IL-18-607位点AA基因型及A等位基因在青霉素过敏病人中所占比例高于正常组（15.5%vs 9.0%,P<0.01；42.1%vs 32.5%,P<0.01）。IL-18-137位点GG基因型和G等位基因在青霉素过敏病人中所占比例低于正常组（69.3%vs 81.3%,P<0.01；84.2%vs 90.5%,P<0.01）。IL-18-607A/C位点和IL-18-137G/C位点,各基因型在皮试阴阳性组间、不同青霉素过敏症状组间、速发或迟发的过敏类型间差异均无统计学意义。4.IL-12B-6415位点GC/GC的基因型和GC等位基因在青霉素过敏病人中所占比例高于正常组（37.6%vs 18.8%,P<0.01;53.9%vs47.7%,P<0.05）。IL-12B 10841位点,在青霉素过敏病人中的CC基因型频率高于正常对照组（35.4%vs22.5%,P<0.05）。IL-12 -6415（CTCTAA/GC）位点,各基因型在皮试阴阳性间、不同青霉素过敏症状组间、速发或迟发的过敏类型间均无明显统计学差异。IL-12B 10841 （C/A）位点,在荨麻疹病人中CC基因型所占比例和C等位基因频率均较对照组明显升高（40.4%vs 22.5%,P<0.05,62.9%vs50.4%,P<0.05）。5.应用SHEsis软件平台进行连锁不平衡分析,IL-18-607A/C和-137G/C位点间不存在连锁不平衡（D’=0.223）; IL-12B -6415 CTCTAA/GC和10841C/A位点间也不存在连锁不平衡（D’=0.203）。6.应用SHEsis软件平台对各位点进行单倍体分析,IL-18基因的AC型单倍体（-607A/-137C）在过敏病人中的频率显著高于正常人（P<0.01）,而CG型单倍体（-607C/-137G）在正常对照组的频率则显著高于过敏病人组；IL-12B基因的GC/C型单倍体（-6415GC/10841C）在过敏病人中的频率显著高于正常人（P<0.01）,而CTCTAA/A型单倍体（-6415CTCTAA/10841A）在正常对照组的频率则显著高于过敏病人组。7.在过敏病人组和对照组内IL-18-607位点上AA、AC、CC基因型间的血清IL-18水平差异无统计学意义（P>0.05）。在过敏病人组IL-18-137位点GG、GC及CC基因型间比较血清IL-18水平发现,GG组的血清IL-18水平明显低于GC+CC组（P<0.05）,在对照组则无差别。8.在过敏病人组和对照组内的IL-12B基因-6415位点或10841位点上的各基因型间的血清IL-12水平差异无统计学意义（P>0.05）。[结论]1.IL-18启动子区的-607C/A位点上A等位基因、137G/C位点上C等位基因和青霉素过敏易感性相关。IL-12B-6415CTCTAA/GC位点上GC/GC基因型和10841C/A位点上CC基因型和青霉素过敏易感性相关。2.IL-18-607A/C位点和IL-18-137G/C位点的各基因型与青霉素病人的皮试情况、青霉素过敏症状及过敏类型无关。3. IL-12-6415（CTCTAA/GC）位点的各基因型与青霉素病人在皮试情况、青霉素过敏症状及过敏类型无明显相关性。IL-12B 10841 （C/A）位点上为CC基因型时,该青霉素过敏病人倾向于出现荨麻疹的症状。4.青霉素过敏病人中IL-18-607A/C和-137G/C位点间、IL-12B -6415 CTCTAA/GC和10841 C/A位点间均不存在连锁不平衡。5.IL-18基因的-607A/-137C单倍体型和IL-12B基因的-6415GC/10841C单倍体型是发生或促进青霉素过敏的危险因素。6.IL-18基因启动子区域的-607位点基因多态性对IL-18血清水平无明显影响；-137位点的多态性对IL-18水平有一定的调控作用,其GG基因型可降低IL-18表达水平。IL-12B基因启动子区域的-6415位点和10841位点基因多态性与IL-12在血清水平无关。第四部分青霉素过敏中差异基因表达及IL-8R分子在青霉素过敏中作用[目的]通过基因芯片技术探索在青霉素过敏病人与正常人间差异基因的表达,从中挑选与细胞因子相关分子,进一步探索该分子在青霉素过敏中的表达情况及作用。[方法]采集青霉素过敏病人及对照人群的外周血并分离其单个核细胞。以表达谱基因芯片技术检测青霉素过敏病人和正常人间的外周血单个核细胞的差异基因表达情况。选取与细胞因子相关的分子IL-8R,以荧光定量RT-PCR及Western Blot检测青霉素过敏病人及对照人群的外周血中IL-8RA和IL-8RB的表达情况。[结果]1.表达谱基因芯片发现青霉素病人组和正常对照间共有3294条（1731条高表达,1563条低表达）差异表达基因；其中差异明显的有1994条,和免疫相关的基因有338条；其中IL-8R这一与细胞因子相关分子在青霉素病人组较对照组明显升高（平均信号强度比值为3.49）2.荧光定量RT-PCR和Western blot检测发现在皮试阴性的青霉素过敏病人IL-8RA mRNA和蛋白表达量较正常组升高（P<0.05）,其中呼吸困难组和荨麻疹组的升高更为明显（P<0.01）；IL-8RB mRNA表达量在皮试阴性的各症状组也均无明显统计差异（P>0.05）。3.在青霉素过敏病人的迟发型组中的IL-8RA mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组（P<0.05）；无论在迟发型或速发型组IL-8RB mRNA和蛋白表达水平与对照组相比均无明显统计学差异（P>0.05）。[结论]1.以表达谱基因芯片技术发现了青霉素病人和正常对照间大量的差异表达基因,为后续探讨青霉素过敏机制提供了候选基因的筛选。2.青霉素过敏病人外周血单个核细胞存在IL-8RA的高表达,其表达水平的升高是青霉素过敏病人出现荨麻疹和呼吸困难的促进因素,且倾向于出现迟发型过敏反应。IL-8RB在青霉素过敏中不起决定性作用。