论文摘要
研究背景支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia, BPD）是长期采用机械通气或氧气治疗低出生体重早产儿严重心肺疾病后最常见的并发症,已经成为威胁早产儿健康和生命质量的首要疾病。随着保护性通气策略的实施、产前糖皮质激素及生后外源性表面活性物质的应用,极低出生体重儿的成活率显著提高,BPD的发病率亦呈逐年上升的趋势,并成为新生儿重症监护病房最为棘手的问题之一。目前国外报道,在出生<30周,体重<1,500 g的60,000名早产儿中,BPD的发病率为20%,体重<750g,发病率为50%,在所有新生儿中的发病率为1.5%。存活者常有慢性肺功能和气体交换异常,需要长期依赖氧气或呼吸机治疗,对家庭和社会带来沉重的经济和精神负担,也严重影响患儿日后的生活质量。因此,研究如何防止或延缓BPD的发生发展,降低BPD的发生率是保护我国有限医疗资源,关乎社会经济发展的重要课题。BPD根据病理学特点分为两种类型,即传统BPD和新型BPD。传统BPD由Northway等由1967年首次提出,表现为肺组织内炎性细胞浸润、肺气肿、肺不张以及肺纤维化改变;目前更为常见的是一种轻型BPD即新型BPD,典型的病理特征主要表现为：肺泡和肺微血管发育不良或发育异常,炎症和纤维化并不明显。通常见于出生体重<1000g,胎龄<26周的极不成熟儿,出生时仅有轻度或无肺部疾病,不需要给氧或仅需低浓度的氧,患儿在住院期间逐渐出现氧依赖,并且持续时间超过纠正胎龄36周。新型BPD的发病机制极其复杂,主要涉及早产、氧化应激、产前感染和产后炎症反应以及肺发育阻滞等多个方面。但其确切的发生机制目前仍不明确。有关新型BPD的发病机制以往的报道多集中在肺泡发育受阻方面,对于BPD的防治一直没有新进展。近来,血管的异常变化在肺发育阻滞中的作用日益受到关注,调控肺血管发育的基因和蛋白也成为国内外研究的新的热点。研究发现：肺微血管发育异常可以导致BPD的发生。调控肺微血管发育的基因表达失衡会干扰肺微血管的正常发育以及减慢肺泡化进程,在BPD的发病机制中起了非常关键的作用。类表皮生长因子样域7（epidermal growth factor-like domain7, EGFL7）是近年来才发现的一种新型的血管内皮细胞特异分泌的蛋白,其属于表皮生长因子样域生长因子家族的一个成员,包含两个表皮生长因子样结构域（epidermal growth factor-like domain）并在进化中高度保守,提示其可能参与蛋白间的相互作用和跨物种的重要生命活动。已有的研究显示,EGFL7基因的表达有其特殊性。其主要高表达于肺,心和肾等血管丰富的组织和胎盘组织,由血管内皮细胞特异分泌到细胞外基质,可能以自分泌的方式促进血管生成。更重要的是,其在胚胎发育和新生儿肺成长过程中,高水平表达。这种独特的表达模式强烈提示：EGFL7很可能是调控肺血管发育的重要因子。Parker等人发现EGFL7为血管管状结构形成所必须,其可以促进血管内皮细胞迁移和黏附,在血管的形成和生成中发挥了至关重要的作用。其是否参与了新型BPD的发生发展过程以及与新型BPD发病机制的关系如何尚不清楚。研究目的1、本研究根据新生大鼠肺泡的发育阶段、时间顺序与人类肺发育相似这一特点,以新生SD大鼠为对象，持续吸人60%的高氧制作新型BPD动物模型,观察60%的高氧对新生大鼠一般状态的影响,应用组织病理学、免疫组织化学、免疫印迹和分子生物学技术,动态观察新生大鼠肺组织病理形态学演变规律;分别从蛋白及分子水平上观察肺组织中EGFL7在新型BPD发生发展中的动态变化规律。2、分析研究EGFL7在新型BPD发病过程中可能的作用,从而为完善新型BPD的发生机制及寻求有效的防治途径奠定一定的实验基础。研究方法1、以足月新生SD大鼠为研究对象,建立60%的高氧诱导的新型BPD动物模型：足月新生SD大鼠在出生12h内,依据吸入氧浓度的不同随机分为实验组和对照组。实验组持续暴露于600ml.L-1氧气中,对照组吸入空气。于生后4天、7天、10天、14天,观察高氧对新生大鼠一般状态的影响, HE染色观察两组肺组织病理变化。2、运用免疫组织化学方法检测两组各时间点肺组织血小板内皮细胞表面黏附分子（PECAM-1）蛋白的表达,以PECAM-1阳性染色的内皮细胞面积与肺实质细胞总面积的百分比代表肺微血管密度,明确高氧诱导肺微血管损伤的变化。3、运用荧光定量逆转录-聚合酶链反应（real-time PCR）技术和免疫印迹（Western Blotting）法分别检测两组肺组织EGFL7mRNA和蛋白的动态表达水平4、采用SPSS 13.0统计软件进行分析。实验数据采用均数±标准差（X±S）表示,EGFL7 mRNA等比较采用析因分析；两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较方差齐性采用One-way ANOVA,方差不齐采用welch检验,对EGFL7蛋白与肺微血管密度两指标采用Pearson相关分析,P<0.05差异有统计学意义。结果1、60%的高氧对新生大鼠一般状态的影响：空气组新生大鼠活动良好,反应灵敏,毛发有光泽,肤色红润,体重增长好。吸氧10d时,部分新生鼠脱氧后可出现轻度的呼吸困难,轻微的发绀；吸氧14d时,新生鼠一般状态较正常鼠变差,体重较对照组明显减轻;脱离氧气后,所有新生鼠均出现不同程度的呼吸困难、头部颤动,周身明显发绀,重新放置氧箱后呼吸困难和发绀可有不同程度的缓解。2、60%的高氧致新生大鼠肺组织病理形态学变化：空气组：出生后4d,肺泡结构较规整,肺泡大小较均匀,肺泡间隔较薄；随着时间的延长,肺泡结构规整,肺泡大小均匀一致,肺泡数量逐渐增加,肺泡间隔渐变薄。高氧组：高氧暴露4d时,肺泡腔内有少许红细胞渗出,肺泡间隔出现少量炎性细胞浸润;高氧暴露7d,肺泡腔逐渐增大,肺泡数量开始减少,肺泡壁变薄,肺间质细胞增加;高氧暴露10d,肺泡腔明显增大,部分肺泡融合,肺泡数量减少,肺间质细胞增生明显。高氧暴露14d,肺泡结构紊乱,肺泡大小不一,大部分肺泡融合,肺泡数量明显减少,大量肺间质细胞增生。3、60%的高氧致新生大鼠肺组织PECAM-1蛋白和微血管密度的动态改变：1)60%的高氧致新生大鼠肺组织PECAM-1蛋白质表达的动态改变：PECAM-1广泛表达于肺微血管内皮细胞的胞浆中。实验组和对照组的PECAM-1蛋白质有显著差异,实验组显著低于对照组。高氧引起PECAM-1蛋白质的差异随着时间的变化有显著的变化趋势。2)60%的高氧致肺组织微血管密度的动态改变：对照组随着时间的延长,肺微血管密度呈现逐渐上升的趋势,至生后第14天达到高峰,实验组出生第4d,7d,10d,14d后,新生大鼠肺组织微血管密度下降,差异均有统计学意义。4、60%的高氧致新生大鼠肺组织EGFL7mRNA和蛋白的动态改变：1)肺组织EGFL7mRNA的表达：对照组可见较高的EGFL7mRNA表达水平,于出生后第10d达高峰；与对照组相比,实验组在出生第4d,7d,10d,14d后,新生大鼠肺组织中EGFL7mRNA表达水平下降,差异均有统计学意义。2)肺组织EGFL7蛋白的表达：对照组新生大鼠可见较高的EGFL7蛋白表达水平。与对照组相比,实验组在出生第4d,7d,10d,14d后,新生大鼠肺组织中EGFL7蛋白表达水平下降,差异均有统计学意义。实验组EGFL7蛋白表达强度与其mRNA表达强度变化基本一致。5、肺组织EGFL7蛋白表达与肺微血管密度的相关性：肺组织EGFL7蛋白表达水平与肺微血管密度呈正相关（r=0.511,P<0.01）。结论1、新生大鼠生后持续吸人60%的高氧14天,肺组织结构发生类似新型BPD的病理改变。表现为肺泡发育障碍,正常肺泡结构消失,肺泡腔明显增大,肺泡数量明显减少,肺泡间隔菲薄,大量肺间质细胞增生。2、60%的高氧导致新生大鼠肺组织PECAM-1蛋白和微血管密度下降,提示高氧破坏内皮细胞,损伤肺血管发育过程,因此导致肺发育障碍。3、60%的高氧导致新生大鼠肺组织EGFL7mRNA和蛋白的表达减少。正常新生大鼠肺组织EGFL7存在一定量的基础表达,60%的高氧导致EGFL7的表达明显降低,推测EGFL7参与了新型BPD的发生发展过程。4、肺血管的生长是正常肺发育的重要环节,推测EGFL7的改变可能是60%的高氧引起肺微血管发育障碍的机制之一
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