论文摘要
目的:临床上肠球菌性心内膜炎发病日益增多,为了更好地研究肠球菌心内膜炎,本实验拟首先建立肠球菌心内膜炎兔动物模型,然后原核表达粪肠球菌心内膜炎抗原（efaA）蛋白,为临床肠球菌心内膜炎致病机制、诊断防治及寻求非抗生素疗法奠定基础。方法:1.动物模型建立:静脉导管插入术建立肠球菌心内膜炎动物模型。模型建立后解剖取兔肺动脉瓣赘生物,通过称量赘生物湿重、计数赘生物分离培养落数、菌落PCR检测、肺动脉瓣病理组织学HE染色,综合评价模型是否建立成功。2. efaA蛋白的原核表达及纯化:Genebank中获得efaA基因全长。PCR扩增efaA基因片段,基因克隆技术构建pET30a-efaA重组载体。采用氯化钙共沉淀法将重组子转化至E.coli DH5α和BL21（DE）。PCR、酶切、测序方法鉴定阳性重组子。IPTG诱导BL21（DE）细菌重组肠球菌efaA蛋白表达,SDS-PAGE、Western Blot方法分析鉴定。His.Bind纯化试剂盒,分析重组蛋白的可溶性,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析。结果:1.成功建立肠球菌心内膜炎兔模型,兔心内膜炎模型心脏可观察到有赘生物生成。肺动脉瓣赘生物重量是148 mg;赘生物匀浆后分离培养菌落计数为8.91 log10CFU/g;菌落PCR检测观察到与目的条带大小一致的特异性条带;肺动脉瓣病理组织学HE染色观察到有大量炎性细胞浸润,并见大量由血小板、纤维素、坏死组织、炎症细胞、大量细菌及肉芽组织所构成的赘生物附着在动脉瓣膜组织上。2.成功构建PET30a-efaA重组子,在pET30a系统中成功表达了efaA融合蛋白,获得小量纯化的重组蛋白。结论:1.成功建立肠球菌心内膜炎兔模型,该模型存在细菌性心内膜炎,有大量赘生物生成。2.在pET30a系统中成功表达了efaA融合蛋白并小量纯化,为进一步大规模表达和纯化efaA蛋白,研究其生物学活性及临床诊断治疗奠定基础。