动物组织中喹噁啉类药物残留检测方法研究

论文摘要

喹嗯啉类药物作为饲料添加剂在我国畜牧业上应用广泛,其在动物体内众多代谢物对药效和毒性均会产生影响。研究建立该类药物及代谢物残留的快速筛选和确证分析方法能够为其安全评估和药理毒理学研究提供参考技术。对喹乙醇进行结构改造合成半抗原,采用活化酯法与牛血清白蛋白偶联后免疫新西兰大白兔,获得喹嗯啉类多克隆抗体,建立了猪肝中8种喹嗯啉类药物及代谢物（喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮、1—脱氧喹赛多、脱二氧喹烯酮、脱二氧乙酰甲喹和喹嗯啉—2—羧酸）残留的间接酶联免疫吸附检测方法。包被原采用2-丙烯酸-1,4-脱二氧喹噁啉。该方法的IC50为0.10-2.50μg·L-1。样品经0.2mol·L-1-乙腈（3+5,v/v）提取,浓缩后检测。在1-100μg·kg-1的添加浓度范围内,各化合物的平均回收率为80.14-96.90%,批内变异系数为5.67-13.82%,批间变异系数为6.22-14.19%。方法的检测限为0.03-0.79μg·kg-1。采用活化酯法合成3—甲基喹噁啉—2—羧酸（MQCA）—牛血清白蛋白偶联物后免疫巴比小鼠,采用体内腹水诱生法获得MQCA的单克隆抗体,建立了猪肝组织中MQCA残留的间接ELISA方法。该方法的ICso为5.72μg·L-1。样品经2mol·L-1盐酸酸解后乙酸乙酯-正己烷-异丙醇（8+1+1）提取,ELISA检测。在1-100μg·kg-1的添加浓度范围内,MQCA的平均回收率为85.44-100.02%,批内变异系数为6.64-10.57%,批间变异系数为7.29-10.88%。该方法的检测限值为0.27μg·kg-1。建立了猪肝组织中喹烯酮及代谢物1—脱氧喹烯酮、4—脱氧喹烯酮、脱二氧喹烯酮和MQCA残留的超高效液相色谱—飞行时间质谱确证分析方法。先采用乙酸乙酯提取,收集提取液。样品残渣中加入盐酸溶液继续提取。用乙酸乙酯萃取盐酸提取液中的MQCA。合并各次的乙酸乙酯提取液于鸡心瓶中。加入磷酸盐缓冲液后旋转蒸发除去乙酸乙酯,MAX混合阴离子小柱净化后上机检测。该方法的检测限为1.4-4.8μg·kg-1,定量限为4.6-15.9μg·kg-1。对猪肝样品进行20-100μg·kg-1的药物空白添加回收实验,各化合物的平均回收率为77.99-86.54%。批内变异系数为2.00-6.62%,批间变异系数为2.13-5.14%。建立了猪肉和虾组织中喹赛多及代谢物喹噁啉—2—羧酸、1-脱氧喹赛多和脱二氧喹赛多残留量的超高效液相色谱—串联质谱确证分析方法。样品经乙腈-0.5mol·L-1盐酸（9+1）提取,MAX混合阴离子交换小柱净化后上机检测。对猪肉和虾进行2-50μg·kg-1的药物空白添加回收试验,各化合物的平均回收率为80.0-94.7%,批内变异系数为1.5-14.6%,批间变异系数为3.1-13.5%。方法的检测限为0.38-1.16μg·kg-1,定量限为2μg·kg-1。建立了猪肝组织中13种喹噁啉类药物及代谢物（卡巴氧、喹噁啉—2—羧酸、喹乙醇、4-脱氧喹赛多、喹赛多、脱二氧喹赛多、4—脱氧喹烯酮、1—脱氧乙酰甲喹、脱二氧喹烯酮、脱二氧乙酰甲喹、喹烯酮、MQCA、乙酰甲喹）残留的超高效液相色谱—串联质谱确证分析方法。用3mol·L-1盐酸对样品进行酸解后,加入0.1%甲酸—乙腈溶液（4+6）提取,HL8小柱净化后检测。10-500μg·kg-1药物空白添加回收试验表明,各化合物的回收率为79.8-93.7%,批内变异系数为3.7-14.0%,批间变异系数为5.3-15.6%。方法的检测限为0.33-2.51μg·kg-1,定量限为1.10-8.37μg·kg-1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 图表目录
• 缩略语表
• 第一章 喹噁啉类药物研究背景
• 1 研究目的和意义
• 2 喹噁啉类药物研究进展
• 2.1 喹噁啉类药物的种类及介绍
• 2.2 喹噁啉类药物的毒性研究
• 2.3 喹噁啉类药物的代谢研究
• 2.4 喹噁啉类药物的残留检测技术研究
• 3 研究内容和方法
• 3.1 研究内容
• 3.2 研究方法
• 第二章 喹噁啉类药物多残留ELISA方法研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂和药品
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 酶联免疫检测溶液系统
• 2 方法
• 2.1 喹噁啉类药物半抗原和抗原的制备
• 2.2 喹噁啉类药物抗体的制备
• 2.3 ELISA检测条件的优化
• 2.4 ELISA检测方法的建立
• 3 结果分析
• 3.1 半抗原的合成和纯化鉴定
• 3.2 人工抗原的合成和鉴定
• 3.3 抗血清的筛选
• 3.4 包被原的筛选
• 3.5 包被原稀释度和抗体稀释度的确定
• 3.6 包被温度和时间的优化
• 3.7 竞争时间的选择
• 3.8 抗体特异性的检测
• 3.9 喹噁啉类药物及主要代谢物标准曲线的建立
• 3.10 ELISA方法灵敏度的测定
• 3.11 ELISA方法准确度和精密度的测定
• 3.12 阳性样品的检测
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 3-甲基喹噁啉-2-羧酸的ELISA方法研究
• 1 材料与设备
• 1.1 试剂和药品
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 试验动物和融合细胞
• 1.4 单克隆抗体制备溶液系统
• 1.5 酶联免疫检测溶液系统
• 1.6 标准溶液和其它溶液
• 2 方法
• 2.1 免疫原和包被原的制备和鉴定
• 2.2 单克隆抗体的制备
• 2.3 ELISA检测程序
• 2.4 ELISA检测条件的优化
• 2.5 猪肉组织样品的检测
• 2.6 方法的准确度、精密度和灵敏度评估
• 2.7 阳性样品的制备和确证检测
• 3 结果与分析
• 3.1 免疫原和包被原的合成和鉴定
• 3.2 单克隆抗体的制备
• 3.3 ELISA检测条件的优化
• 3.4 ELISA方法特异性的检测
• 3.5 ELISA方法的验证
• 3.6 阳性样品检测
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 喹烯酮及其代谢物的残留确证分析方法研究
• 1 材料与设备
• 1.1 药品及代谢物来源
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液
• 2 试验方法
• 2.1 动物实验
• 2.2 仪器分析条件
• 2.3 样品前处理过程
• 3 结果与分析
• 3.1 UPLC-Q-TOF MS条件的优化
• 3.2 喹烯酮及其代谢物的Q-TOF-MS定量分析方法的建立
• 3.3 喹烯酮及其代谢物的Q-TOF-MS/MS定性确证分析
• 3.4 喹烯酮及其代谢物的Q-TOF-MS定量分析方法的验证
• 3.5 实际样品检测
• 4. 讨论
• 4.1 方法学讨论
• 4.2 样品前处理方法的研究
• 5. 小结
• 第五章 喹赛多及其代谢物的残留确证分析方法研究
• 1 材料与设备
• 1.1 材料
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要溶液
• 2 试验方法
• 2.1 样品的制备
• 2.2 样品前处理
• 2.3 检测条件的设置
• 2.4 基质匹配标准曲线的绘制
• 2.5 检测限与定量限的测定
• 2.6 准确度、精密度和重复性的测定
• 2.7 样品的确证
• 3 结果与分析
• 3.1 仪器分析条件的优化
• 3.2 检测方法的线性关系验证
• 3.3 检测限和定量限的确定
• 3.4 方法的准确度、精密度和重复性
• 3.5 方法的确证分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第六章 喹噁啉类药物及其主要代谢物的多残留确证分析方法研究
• 1 材料与设备
• 1.1 药品及代谢物来源
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要溶液
• 2 方法
• 2.1 样品的制备和来源
• 2.2 仪器分析条件
• 2.3 样品前处理过程
• 3 结果与分析
• 3.1 样品溶解液对13种化合物色谱行为的影响
• 3.2 质谱条件的优化研究
• 3.3 基质匹配标准曲线的制备
• 3.4 检测限和定量限的确定
• 3.5 方法的准确度、精密度和重复性
• 3.6 方法的确证分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 第七章 结论和创新点
• 1 结论
• 1.1 制备了喹噁啉类药物多克隆抗体,建立了喹噁啉类药物及其代谢物多残留的酶联免疫测定方法
• 1.2 制备了3-甲基喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体,建立了三种喹噁啉类药物共同代谢物的酶联免疫测定方法
• 1.3 建立了喹烯酮及其代谢物多残留的超高效液相色谱—飞行时间质谱确证分析方法
• 1.4 建立了喹赛多及其代谢物多残留的超高效液相色谱—串联质谱确证分析方法
• 1.5 建立了喹噁啉类药物及其代谢物多残留的超高效液相色谱—串联质谱确证分析方法
• 2 创新点
• 2.1 制备了包被半抗原2-丙烯酸-1,4-二氮喹噁啉,并将其用于酶联免疫检测方法
• 2.2 建立了猪肝中8种喹噁啉类药物及代谢物多残留的ELISA测定方法和3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的ELISA快速筛选方法
• 2.3 建立了动物组织中喹烯酮及其代谢物、喹赛多及其代谢物和13种喹噁啉类药物及代谢物多残留的液相色谱-质谱联用确证分析方法
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历