论文摘要
目的 1.从竹叶青蛇毒中分离去整合素,并鉴定其理化性质和生物学活性。 2.合成竹叶青蛇毒去整合素Trigramin基因,并在大肠杆菌中表达。 方法 1.运用凝胶过滤和反相高效液相色谱技术,从竹叶青蛇毒中分离出去整合素;通过HPLC和SDS-PAGE鉴定其理化性质及纯度;通过血小板聚集实验分析蛇毒去整合素对血小板聚集的抑制作用。 2.根据竹叶青蛇毒去整合素Trigramin的基因序列合成Trigramin基因的四个片段,通过缓慢退火PCR的方法将其拼接为完整的Trigramin基因;经BamHⅠ及Sac Ⅰ双酶切后定向克隆到原核表达载体pET-42a（+）中,PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21（DE3 pLysS）;IPTG诱导GST-Trigramin融合蛋白表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物;GSTrap FF亲和层析柱纯化融合蛋白;血小板聚集实验分析GST-Trigramin对血小板聚集的抑制作用。 结果 1.通过凝胶过滤和反相层析从竹叶青蛇毒中分离得到一个去整合素,经HPLC和SDS-PAGE证实为单一组分,分子量约9.5kDa。 2.该去整合素在较低的浓度下即可强烈抑制ADP诱导的血小板聚集,且抑制作用呈明显的量效关系,半数抑制浓度(IC50)为2.42μg/ml（250nmol/L）。 3.合成了去整合素Trigramin基因;构建表达质粒pET-42a（+）-Trigramin,经测序鉴定证实Trigramin基因已正确插入质粒载体的多克隆位点。