木霉菌-油菜联合吸附重金属技术构建与作用机理初步研究

论文摘要

木霉（Trichoderma spp.）不仅是一类重要的植物病害的生防真菌,同时还证明是降解和转化环境污染物,如重金属,DDT等的环境微生物。油菜（Brassica napus）是我国的主要农作物之一,其中甘蓝型油菜在我国南方地区广泛种植,已有研究表明:甘蓝型油菜也具有修复Cd污染土壤的能力。然而无论是单一的木霉菌,还是单一的油菜本身在吸收重金属的能力均有一定的局限性,因此如何通过木霉菌与油菜的联合作用提高从土壤中吸收重金属的效率,具有重要意义。以往少数报道是利用野生木霉与油菜互作提高吸收重金属的效率,尚无研究利用木霉菌REMI（限制性内切酶介导的基因整合）突变株与油菜的联合作用,而木霉菌突变株可为今后扩大与油菜亲和互作的改良和高效筛选提供了可能。本试验拟筛选可吸附土壤重金属Cd的甘蓝型油菜品种和木霉菌突变株,进而组配修复重金属污染土壤的木霉-油菜共生体。木霉菌除可促进油菜植株吸附重金属Cd外,还能使油菜免受油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的侵染。通过人工接种重金属Cd的盆栽试验,首先评价了上海地区种植的12个甘蓝型油菜品种对镉的耐受和富集能力,从中筛选出了对土壤中Cd有明显耐受、富集作用,适合长三角地区种植和土壤修复的油菜品种--沪油20。沪油20油菜品种可以做为与木霉菌联后修复Cd污染土壤的候选植物。然后,从REMI突变株中筛选出2株对重金属Cd具有较高耐受和吸附能力的菌株P6和H6。拮抗性和促进生长试验表明:由P6和H6制备的土壤修复剂对油菜沪油20幼苗生长有明显刺激作用,同时对菌核病菌生长也有明的抑制作用,盆栽试验进一步证明这两个突变株均能明显防治油菜菌核病,其中P6和H6复合处理防效在80%以上。木霉菌突变株-油菜吸附重金属的机理初步研究表明:木霉菌突变株处理后镉在油菜细胞壁和叶绿体内均有吸附,但在细胞壁上的吸附增加较明显,另外发现由于木霉菌刺激油菜过量吸附镉,可导致油菜叶片细胞核破坏。蛋白质组学的初步研究证明了REMI是一种可以使木霉菌获得高耐受镉能力突变株的有效方法。通过检测沪油20在两菌株不同组合制备的土壤修复剂处理下,株高,干重,相对生物量及净化率的变化,确定木霉突变株-油菜最佳组合为P6+H6:油菜沪油20,该组合作用可明显提高沪油20对Cd污染土壤的净化率,同时抵抗油菜菌核病菌的侵染,确保木霉-油菜共生体在修复污染土壤过程中的安全生长,同时为植物-微生物共同作用修复农田重金属污染土壤机理及其应用技术奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章文献综述
• 1.1 REMI 插入突变技术
• 1.1.1 REMI 转化及其优缺点
• 1.1.2 REMI 的机理
• 1.1.3 REMI 对转化质粒的要求
• 1.1.4 REMI 技术的进展
• 1.2 土壤重金属污染
• 1.2.1 我国农田重金属污染现状
• 1.2.2 上海地区土壤污染状况
• 1.3 重金属污染的处理技术
• 1.3.1 植物修复技术
• 1.3.1.1 重金属高累积植物
• 1.3.1.2 重金属植物修复机理
• 1.3.1.3 植物修复镉污染土壤的调控措施
• 1.3.2 植物-微生物联合作用修复重金属污染物状
• 1.3.2.1 土壤修复剂研究进展
• 1.3.2.2 土壤微生物修复剂的作用原理及主要类型
• 1.3.2.3 微生物土壤修复剂发展所存在的问题及发展方向
• 1.4 展望
• 1.4.1 植物-微生物联合作用修复重金属污染的问题和发展方向
• 1.4.2 生物工程技术应用于重金属污染防治实践
• 1.4.3 木霉菌多功能微生物菌剂的开发应用亟待提高
• 第二章 富集土壤锌、镉离子的甘蓝型油菜品种的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 催芽与播种
• 2.2.2.2 油菜植株组织内含 Zn、Cd 含量分析
• 2.3 结果与分析
• 2+、Zn²⁺、Cu²⁺对油菜生长发育的影响'>2.3.1 重金属Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺对油菜生长发育的影响
• 2+、Cd²⁺能力测定'>2.3.2 不同油菜品种耐受土壤Zn²⁺、Cd²⁺能力测定
• 2+、Cd²⁺能力测定'>2.3.3 不同油菜品种富集 Zn²⁺、Cd²⁺能力测定
• 2.4 结论与讨论
• 2+、Cd²⁺的品种'>2.4.1 甘蓝型油菜中存在高吸附Zn²⁺、Cd²⁺的品种
• 2+、Cd²⁺油菜品种的重要指标'>2.4.2 地上部生物量是筛选耐受和富集 Zn²⁺、Cd²⁺油菜品种的重要指标
• 2+机理'>2.4.3 油菜耐受和富集Zn²⁺机理
• 第三章 耐受和吸附重金属木霉菌 REMI 突变体筛选
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 耐受和吸附重金属试验
• 3.2.2.2 木霉菌及其突变株与病菌菌对峙培养
• 3.3 结果与分析
• 2+活性测定'>3.3.1 突变株耐受和吸附 Cd²⁺活性测定
• 2+、Zn²⁺活性测定'>3.3.2 转化子耐受和吸附Cu²⁺、Zn²⁺活性测定
• 3.3.3 拮抗菌核病菌木霉转化子的活性测定
• 3.3.4 影响抗性木霉菌生长的土壤因子研究
• 3.3.4.1 土壤酸碱度对抗性木霉菌生长的影响
• 3.3.4.2 土壤湿度对木霉菌生长的影响
• 3.3.4.3 土壤温度对木霉菌生长的影响
• 3.3.4.4 不同土质对木霉菌生长的影响
• 3.3.4.5 微量元素对木霉菌生长的影响
• 3.4 结论与讨论
• 第四章 木霉菌与油菜共生体构建与重金属吸附效率
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.2.1 催芽与播种
• 4.2.2.2 油菜植株组织内含Cd 含量分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 不同野生木霉及其突变体处理对沪油20生长的影响
• 4.4 结论与讨论
• 第五章 木霉菌-油菜联合吸附镉作用机理初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 村料与方法
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.1.1 电镜样品制备与试剂配制
• 5.2.1.2 蛋白质组学研究
• 5.2.2 试验方法
• 5.2.2.1 透射电镜样品制备与观察
• 5.2.2.2 蛋白质组学研究方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 木霉菌-油菜吸附重金属超微观察
• 5.3.2 蛋白质图谱分析
• 5.4 结论与讨论
• 第六章 油菜-木霉菌土壤联合吸附重金属污染土壤田间试验
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试验材料
• 6.2.2 试验方法
• 6.2.2.1 试验土壤重金属背景含量测定
• 6.2.2.2 不同木霉菌土壤修复剂处理对沪油20 吸附 Zn，Cd，Cu 的影响
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 木霉菌土壤修复剂的制备
• 6.3.1.1 不同培养物种类在对木霉菌产孢的影响
• 6.3.1.2 添加不同腐殖酸钠对木霉菌产孢的影响
• 6.3.1.3 不同含水量对木霉菌产孢的影响
• 6.3.2 木霉菌土壤修复剂对油菜生长及吸附重金属作用的影响
• 6.3.3 木霉菌土壤修复剂对油菜菌核病的防治效果
• 6.4 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录