大肠杆菌中多顺反子表达人血小板因子4

论文摘要

血小板第4因子（platelet factor4, PF4）是CXC趋化因子家族中的一员，储存于血小板α颗粒，血小板活化后得以释放。除了肝素中和作用外，PF4有多种生物功能：对人单核细胞和中性白细胞的趋化性，参与成纤维细胞的黏附，免疫调节和抑制肿瘤细胞的生长等。PF4属于小分子多肽，在体内易降解，半衰期短，因此其克隆、表达等常遇到一些困难，在一定程度上制约了其工业化生产。本文采用多顺反子串联表达策略，提高PF4的表达量，为其工业化生产、深入研究和临床应用奠定基础。首先，根据优化后的人PF4DNA序列设计引物，重叠PCR得到人PF4DNA序列，连接T载体；其次，又设计串联单位、第一串联单位和相应引物，重叠PCR获得串联单位和第一串联单位的DNA序列，分别连接T载体，标记为pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-f PF4；再次，用同尾酶对质粒pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-f PF4酶切、连接，得到质粒pEASY-T1-2f PF4；同理，对质粒pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-2f PF4酶切、连接，可得质粒pEASY-T1-3f PF4；依次循环可得pEASY-T1-nfPF4（n=4,5,6）；最终，双酶切质粒pBV220、pET28a（+）和pEASY-T1-nf PF4（n=1,2…6），分别连接大小片段，连接产物分别转化E. coliDH5α和BL21（DE3），获得工程菌E. coli DH5α/pBV220-nf PF4和E. coliBL21（DE3）/pET28a（+）-nf PF4（n=1,2…6）。工程菌E. coli DH5α/pBV220-nf PF4经诱导表达，重组PF4蛋白没有表达或表达极少；工程菌E. coliBL21（DE3）/pET28a（+）-nf PF4培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为0.6mM的IPTG，在23°C下诱导表达12小时，PF4包涵体和可溶性蛋白均有产生；SDS-PAGE电泳和Western blot检测全菌蛋白时，发现随着拷贝数的增加，表达逐渐增加，至4个拷贝时，趋于平衡，其中工程菌E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-nfPF4（n=4,5,6）中，重组PF4分别占菌体总蛋白的44.45%、44.03%和43.28%。选工程菌E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-4f PF4诱导表达，上清可溶性蛋白经Ni亲和纯化柱和凝胶脱盐柱后其纯度可达95%以上；纯化的融合蛋白经肠激酶酶切和质谱鉴定，确为PF4。用集落形成试验验证重组人PF4的活性，发现融合蛋白可抑制HEL细胞集落的形成，抑制率为55.6%。本论文从解决重组小分子多肽药物产量低、纯化困难和纯化后的目标产品末端不能完全忠实于野生型氨基酸序列等技术难题入手，有效地改进了PF4生产工艺，同时也为其它小分子多肽药物生物合成提供了崭新的思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 血小板第四因子（PF4）的概述
• 1.2 PF4 的重组表达
• 1.2.1 原核表达系统
• 1.2.2 甲醇酵母表达系统
• 1.2.3 家蚕、幼虫表达系统
• 1.3 串联技术在小分子多肽中的应用
• 1.4 多肽的分离纯化
• 1.4.1 亲和色谱
• 1.4.2 离子交换色谱
• 1.4.3 疏水作用色谱
• 1.4.4 凝胶过滤色谱
• 1.4.5 共价色谱
• 1.4.6 反相色谱
• 1.5 本文研究的主要内容
• 第二章 血小板因子 4 基因、串联单位及第一串联单位的克隆
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与载体
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.1.4 引物合成
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 PF4 基因、串联单位及第一串联单位的 PCR 扩增策略
• 2.2.3 PF4 基因、串联单位及第一串联单位的扩增
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 第三章 工程菌的构建与表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种和载体
• 3.1.2 主要实验试剂
• 3.1.3 主要实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 pEASY-T1-nf PF4 （n=1, 2…6） 载体的构建
• 3.2.2 工程菌 E. coli DH5α/pBV220-nf PF4 和 E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-nfPF4 （n=1, 2…6）的构建
• 3.2.3 工程菌 E. coli DH5α/pBV220-nf PF4 和 E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-nfPF4 （n=1, 2…6）的诱导表达
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 工程菌 E. coli DH5α/pBV220-nf PF4 和 E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-nfPF4 （n=1, 2…6）的构建
• 3.3.2 工程菌 E. coli DH5α/pBV220-nf PF4 和 E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-nfPF4 （n=1, 2…6）的初步诱导表达
• 3.3.3 工程菌 E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-nf PF4 （n=1, 2…6）表达量的比较与Western blot 检测
• 3.3.4 工程菌 E. coli BL21（DE3）/pET28a（+）-4f PF4 表达条件的优化
• 3.4 讨论
• 第四章 重组蛋白的分离纯化、鉴定和活性实验
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种和载体
• 4.1.2 主要实验试剂
• 4.1.3 主要实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 重组融合蛋白 His-PF4 的分离纯化
• 4.2.2 重组融合蛋白 His-PF4 的鉴定
• 4.2.3 活性实验
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 重组融合蛋白 His-PF4 的分离纯化
• 4.3.2 重组融合蛋白 His-PF4 的鉴定
• 4.3.3 活性实验
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢