番茄几个耐盐相关基因的克隆及功能初步分析

论文摘要

土壤盐渍化是限制作物生长发育的主要非生物逆境之一。改良盐渍土壤和提高植物的耐盐性是现代农业发展的重要目标。本研究在前期番茄耐盐研究中发现的盐胁迫早期响应基因的基础上,克隆其全长cDNA,构建超表达和RNAi载体,转化番茄,初步分析转基因番茄的耐盐性,为下一步系统分析关键基因的生物学功能及其作用的分子机理奠定基础。获得主要结果如下:1.克隆了5个番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）盐胁迫早期响应基因的全长cDNA,其中包括2个NAC类基因（SINAC1,SINAMI）,1个锌指类转录因子（SlZF1）和2个功能未知基因（SlSRG1,SlSRG2）。序列分析表明,SlNAC1全长cDNA为1327 bp,编码301个氨基酸（aa）,其GenBank登录号（GI）为EU670750,aa比对结果表明SINAC1与其他植物NAC类基因的同源性较高。SlNAM1全长cDNA为1218 bp,完整的读码框共编码296 aa,该基因与其他植物的同类基因同源性较高,其GI为EU670749。由于SlNAC1和SlNAM1都属于同一类转录因子,利用MEGA 3.1软件构建了其分子系统进化树;利用SOPMA和SWISS-MODEL完成二者蛋白质二级和三级结构的预测,结果表明这两个基因编码的蛋白符合NAC类转录因子的结构特征。SlZF1属于锌指类转录因子,全长cDNA为1084 bp,共编码260 aua,GI为EU670748。aa比对结果显示该基因与其他植物同类基因的同源性较低。SlSRG1和SlSRG2是两个全新基因,SlSRG1全长cDNA为1299 bp,共编码287 aa,其GI为EU670751。SlSRG2全长cDNA为1810 bp,编码499 aa,GI为EU670752。2.构建各基因的超表达载体和RNAi载体,转化番茄,获得SlNAC1、SlNAM1和SlSRG2超表达载体转化再生植株分别为13株、15株和4株。PCR检测结果初步表明对应T-DNA已经整合到番茄基因组中。3.半定量RT-PCR检测表明靶基因在不同转基因单株中表达差异较大。4.完成转基因植株后代的分离鉴定,获得多个后期研究所需的群体。5.利用半定量RT-PCR调查了5个基因在番茄LA2711上的组织（根、茎、叶、花、青果、红果）表达谱,为这些基因的后期生物学功能研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 前言
• 1 课题提出
• 2 耐盐相关的信号途径
• 2+信号途径相关基因'>2.1 Ca²⁺信号途径相关基因
• 2.1.1 SOS信号途径相关基因
• 2.1.2 钙依赖型蛋白激酶信号途径
• 2.2 MAPK参与的信号传导途径相关基因
• 2.3 ABA信号途径相关的基因
• 2.4 其他信号传导途径相关的基因
• 3 离子调节相关的基因
• 4 渗透调节物质及相关蛋白的基因
• 5 氧化调节相关酶的基因
• 6 转录因子的结构特点及主要类别
• 6.1 转录因子的结构特点
• 6.2 植物主要的转录因子及特点
• 6.2.1 MYB转录因子
• 6.2.2 bZIP类转录因子
• 6.2.3 AP2/EREBP类转录因子
• 6.2.4 锌指类转录因子
• 6.2.5 NAC类转录因子
• 7 研究新基因功能的主要方法
• 7.1 超表达技术
• 7.2 RNAi和反义RNA
• 7.3 染色质免疫共沉淀技术（ChIP）及与芯片方法结合
• 7.4 酵母双杂交
• 8 本课题的意义
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株、质粒及试剂
• 1.2 植物材料
• 2 实验方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）引物
• 2.3 基因克隆特异引物
• 2.4 其他引物
• 2.5 RACE扩增
• 2.6 基因克隆、测序及分析
• 2.7 超表达载体的构建
• 2.9 RT-PCR
• 2.10 基因组织特异性表达分析
• 2.11 番茄的遗传转化
• 2.12 转基因植株的PCR鉴定
• 2.13 目的基因在超表达转基因单株上的表达分析
• 1代分离植株'>2.14 利用卡那霉素喷施法筛选T₁代分离植株
• 1转基因植株分离的PCR检测'>2.15 T₁转基因植株分离的PCR检测
• 结果与分析
• 1 SlNAM1、SlNAC1、SlZF1、SlSRG1、SlSRG2的克隆与分析
• 1.1 SlNAM1、SlNAC1、SlZF1、SlSRG1、SlSRG2的克隆
• 1.2 番茄SlNAC1、SlNAMl的序列分析及二级结构预测
• 1.2.1 番茄SlNAC1、SlNAM1的序列分析
• 1.2.2 番茄SlNAC1、SlNAM1与其他植物相关基因的进化关系
• 1.2.3 番茄SlNAC1、SlNAM1基因二级结构的预测分析
• 1.3 番茄SlZF1基因序列分析及系统进化树绘制
• 1.3.1 番茄SlZF1基因序列分析
• 1.3.2 番茄SlZF1与其他植物相关基因的进化关系
• 1.4 番茄SlSRG1和SlSRG2基因序列分析
• 2 植物载体的构建
• 2.1 植物超表达载体的构建
• 2.2 RNAi载体的构建
• 3 转基因植株的获得
• 3.1 再生植株的获得
• 3.2 转基因植株的PCR检测
• 4 转基因植株的RT-PCR分析
• 4.1 SlNAC1基因超表达转基因植株的RT-PCR分析
• 4.2 SlNAM1基因超表达转基因植株的RT-PCR分析
• 1转基因植株的分离鉴定'>5 T₁转基因植株的分离鉴定
• 5.1 卡那霉素喷施法鉴定分离植株
• 5.2 T1转基因植株的PCR检测
• 讨论
• 1 SlNAC1与SlNAM1的功能分析
• 2 SlZF1的功能分析
• 3 SlSRG1与SlSRG2的功能分析
• 0转基因植株表达分析'>4 T₀转基因植株表达分析
• 5 关于后期工作的设想
• 参考文献
• 致谢
• 附录一:植物DNA的小量法提取程序
• 附录二:质粒的小量提取方法
• 附录三:相关的载体图:
• 附录四:TRIZOL一步法提取植物总RNA方法
• 附录五:相关基因登陆的信息