氟对大鼠成骨细胞Nrf2-ARE信号转导通路的作用研究

论文摘要

研究背景及目的氟是机体必需的微量元素之一,对全身骨骼生长发育和维持骨骼生理结构功能具有重要作用。但机体摄入过量氟则会引起氟斑牙和氟骨症等骨相损害。近年来,虽然地方性氟中毒的防治工作已取得很大成就,但地方性氟中毒仍然严重影响着病区人民的健康。因此,深入揭示氟中毒的发病机制,在地方性氟中毒所致健康损害的防治方面,具有重要意义。目前,虽然氟中毒发病的分子生物学机制尚未充分阐明,但氟诱导的氧化应激所介导的细胞凋亡仍然被认为是慢性氟中毒形成的关键机制之一。氟中毒时可引起机体发生氧化应激导致体内活性氧簇（Reactive oxygen species, ROS）增高,低浓度的ROS作为细胞内反应的信号中间传递体,通过介导体内某些氧化应激敏感性的信号转导途径而发挥重要作用。近年来,有研究发现核转录因子NF-E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2）和它的胞质接头蛋白（Kelch 1ike ECH associated protein 1, Keap1）是细胞抗氧化应激的中枢调节者,由此它在抗氧化应激方面所起的作用受到越来越多的关注。Nrf2需与其它bZIP转录因子形成异源二聚体后再与抗氧化反应元件（Antioxidant response element, ARE）结合才能够调节和编码抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达,增加细胞对氧化应激的抵抗作用,维持机体生存。Nrf2-ARE通过激活细胞的抗氧化机制及抑制细胞的炎症信号通路,在机体抗氧化应激方面起着重要的作用。当血红素氧合酶-1（ heme oxygenase-1, HO-1）和醌氧化还原酶1（ NADP（H）:quinone oxidoreductase 1 , NQO1）被Nrf2诱导表达后,能增强机体的抗氧化能力。本研究利用原代培养的大鼠成骨细胞,研究氟对成骨细胞氧化应激,DNA损伤,细胞增殖与凋亡, HO-1和NQO1的基因表达及Nrf2基因表达和其蛋白含量的影响,探讨Nrf2-ARE信号转导通路在氟致成骨细胞损害中的作用。方法1实验方法1.1成骨细胞的培养与鉴定初生（12d）SPF级的SD大鼠购自广东省广州中医药大学实验动物中心。无菌条件下分离大鼠颅盖骨进行成骨细胞的原代培养,细胞常规培养于DMEM培养液（含15%FBS,200∪/ml双抗）,5%CO2、37℃条件下培养。待细胞达到80%90%融合时,以1:2进行传代。培养的细胞经形态学观察、NBT/BCIP法染色鉴定,并绘制细胞的生长曲线。1.2成骨细胞形态观察及细胞增殖测定将成骨细胞接种于6孔培养板,观察氟对成骨细胞形态的影响并摄片;将相同数量的成骨细胞接种于96孔板,培养24h后,按NaF终浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L进行染毒,继续培养24h、48h和72h,用MTT法检测细胞的增殖能力。1.3细胞周期和凋亡率的检测将细胞接种于6孔板培养24h后染氟24h、48h和72h,分别收集12000个细胞,用流式细胞仪在激发光波长Ex=488nm,发射光波长Em=530nm下分析PI荧光的直方图。采用美国PHEONIX公司的MULTYCYCLE软件进行细胞周期的分析,采用WINMDI软件进行细胞凋亡率的分析。1.4成骨细胞氧化应激水平测定将细胞接种于24孔板培养24h后染氟24h、48h和72h,收集所得细胞悬液,采用亚硝酸盐法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性,采用二硫双硝基苯甲酸（DTNB）法测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量。1.5成骨细胞DNA损伤的测定用单细胞凝胶电泳实验（SCGE）检测成骨细胞DNA的拖尾及损伤情况:制备琼脂载玻片,在荧光显微镜下观察结果并摄片,用SCGE图像分析系统IMI1.0逐个分析细胞;用酶联免疫实验（ELISA）检测细胞内DNA氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量:细胞接种及染毒24h、48h和72h后,收集所得细胞,使用8-羟基脱氧鸟苷检测试剂盒和酶标仪检测细胞内8-OHdG的含量。1.6 RNA提取和RT-PCR实验将细胞接种于10cm培养皿,实验分为:单纯染氟组,tBHQ预处理组。用Trizol试剂盒提取成骨细胞的总RNA,用PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒检测单纯染氟组和tBHQ预处理组成骨细胞内HO-1 mRNA和NQO1 mRNA及核转录因子Nrf2 mRNA的表达。1.7免疫蛋白印迹（western blotting）实验将细胞接种于10cm培养皿,实验分为:单纯染氟组,tBHQ预处理组。用NucbusterTM Protein Extraction Kit试剂盒提取核蛋白和浆蛋白,BCA蛋白试剂盒对蛋白含量定量,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用湿转法将蛋白转印至PVDF膜上（250mA,80min）。用5%脱脂牛奶对PVDF膜进行孵育,用一抗Nrf2（1:300）和内参?-actin（1:500）,二抗两者都为1:2000浓度杂交,按照ECL发光试剂盒操作步骤进行化学发光反应,并对其进行曝光显像,用凝胶成像分析系统进行蛋白灰度值分析,结果用实验组与对照组的平均灰度值的相对值表示。2统计分析各实验组数据均以均数±标准差（x±s）表示,采用SAS9.0统计软件进行分析。满足正态性分布且方差齐的两组之间差异的比较用两组独立样本的t检验,多组之间差异的比较用单因素的方差分析,组间两两比较用SNK检验法,数据不满足正态性检验时用非参数检验,显著性水平ɑ=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1细胞培养与鉴定刚分离的细胞在倒置显微镜下观察呈微小透亮的圆球形,折光性强,细胞贴壁后主要呈短梭形、细长梭形、三角形及不规则形。细胞经形态学观察和NBT/BCIP法染色鉴定为成骨细胞。2氟对成骨细胞形态及细胞增殖活性的影响对照组可见细胞已汇合成致密单层,重叠生长、聚集成团的增殖状态,低剂量组细胞数量有所减少,并出现少量空泡的细胞,高剂量组可见细胞数目明显减少、细胞间隙增大、空泡增多。随着染氟浓度的增加和染氟时间的延长,成骨细胞的增殖活性均受到抑制,细胞的存活率呈下降趋势（P<0.05）。3氟对成骨细胞细胞周期和凋亡的影响氟对成骨细胞周期的影响主要表现为促使G0/G1期细胞增多,S期及G2/M期细胞减少;0.25,0.50,1.00,2.00mmol/L剂量组细胞凋亡不明显,差异无统计学意义。4.00mmol/L剂量组氟对细胞凋亡的诱导作用显著,凋亡率明显升高（P<0.05）。4氟对成骨细胞氧化应激指标的影响染氟24h和48h段,与对照组比较,随着染氟浓度的增加成骨细胞内主要的抗氧化酶SOD和GSH-Px活性存在下降的趋势,但72h段,SOD活性先下降后升高;而各时段高剂量组脂质过氧化产物MDA含量则较对照组明显升高（P<0.05）。5氟对成骨细胞DNA损伤的影响染氟24h,成骨细胞DNA损伤不明显,染氟48h、72h后,各剂量组的细胞DNA尾长、Olive尾距、尾DNA%及尾/头长比与对照组相比增加,并随着浓度的增加而逐渐升高,差异具有统计学意义（P <0.05）,但当4.00mmol/L剂量组时,上述指标较之前剂量有所降低。细胞内DNA氧化损伤产物8-OHdG的含量随着染氟浓度的增加呈升高的趋势（P<0.05）。6氟对成骨细胞Nrf2 mRNA表达及蛋白含量的影响单纯染氟组:随着染毒浓度的增加,在24h和48h段NaF能够持续诱导成骨细胞内核转录因子Nrf2 mRNA的表达,但随着染毒时间延长至72h,这种诱导作用变的不明显;细胞染毒24h、48h后NaF能够持续使细胞浆中Nrf2蛋白含量下降,而细胞染毒48h后NaF能够持续使细胞核中Nrf2蛋白含量升高。tBHQ预处理组:tBHQ预处理12h后再加氟处理24h、48h和72h,Nrf2 mRNA的表达反较单纯染氟组下降,在24h段核蛋白中Nrf2蛋白含量较同组单纯染氟组升高。7氟对成骨细胞HO-1及NQO1 mRNA表达的影响单纯染氟组:单纯染氟24h和72h,大鼠成骨细胞内HO-1及NQO1 mRNA表达未观察到明显变化;单染氟48h,0.25mmol/L组细胞内HO-1及NQO1 mRNA表达显著升高（P<0.05）;0.50、2.00和4.00mmol/L组细胞内HO-1 mRNA表达较对照组明显下降（P<0.05）,而4.00mmol/L组细胞内NQO1 mRNA表达显著升高。tBHQ预处理组:24h和72h段HO-1 mRNA表达较单纯染氟组下降;在48h段,4.00mmol/L组能够诱导HO-1 mRNA表达升高; 24h段4.00mmol/L组细胞内NQO1mRNA表达较同组的单纯染氟组下降;48h段,0.25 mmol/L组NQO1 mRNA表达较同组的单纯染氟组下降;72h段,0.50、2.00、4.00mmol/L组NQO1 mRNA表达较同组的单纯染氟组下降（P<0.05）。结论1氟能抑制成骨细胞增殖,改变细胞周期,但只有高剂量（4.00mmol/L）时成骨细胞才发生显著凋亡。2氟可致大鼠成骨细胞发生脂质过氧化并造成DNA损伤,同时也能降低细胞内抗氧化酶的活性。3氟可诱导大鼠成骨细胞Nrf2基因的表达和蛋白含量的增加,进而使Nrf2-ARE下游靶基因HO-1和NQO1表达增加,使细胞的抗氧化能力增强。4在本研究条件下,tBHQ预处理成骨细胞后Nrf2蛋白及HO-1和NQO1 mRNA表达较单纯染氟组下降。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 1 实验动物与细胞的来源
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验细胞
• 2 实验试剂
• 2.1 细胞培养所需试剂
• 2.2 氧化应激测定所需试剂
• 2.3 彗星实验所需试剂
• 2.4 RT-PCR 所需试剂
• 2.5 Western Blotting 所需试剂
• 3 实验溶液的配置
• 4 实验仪器
• 5 实验方法
• 5.1 成骨细胞培养方法
• 5.2 成骨细胞形态及增殖活性的测定
• 5.3 成骨细胞的细胞周期与凋亡率的测定
• 5.4 成骨细胞氧化应激水平的测定
• 5.5 成骨细胞DNA 损伤的测定
• 5.6 成骨细胞内基因表达的测定（RT-PCR 法）
• 5.7 成骨细胞内Nrf2 蛋白的测定（Western Blotting 法）
• 5.8 统计分析
• 结果
• 1 成骨细胞的培养与鉴定
• 1.1 正常成骨细胞的形态观察
• 1.2 成骨细胞的鉴定
• 1.3 成骨细胞生长曲线的测定
• 2 氟对成骨细胞的形态及增殖活力的影响
• 2.1 氟对成骨细胞形态的影响
• 2.2 氟对成骨细胞增殖活性的影响
• 2.3 氟对成骨细胞存活率的影响
• 3 氟对成骨细胞细胞周期及细胞凋亡率的影响
• 3.1 氟对成骨细胞细胞周期的影响
• 3.2 氟对成骨细胞凋亡率的影响
• 4 氟对成骨细胞氧化应激的影响
• 4.1 氟对成骨细胞SOD 活性的影响
• 4.2 氟对成骨细胞GSH-Px 活性的影响
• 4.3 氟对成骨细胞脂质过氧化产物MDA 含量的影响
• 5 氟对成骨细胞DNA 损伤的影响
• 5.1 氟对成骨细胞DNA 链断裂的影响
• 5.2 氟对成骨细胞8-OHdG 含量的影响
• 6 氟对成骨细胞 Nrf2 基因表达及其蛋白含量的影响
• 6.1 氟对成骨细胞Nrf2 mRNA 表达的影响
• 6.2 氟对成骨细胞Nrf2 蛋白含量的影响
• 7 氟对成骨细胞内 HO-1 mRNA 及 NQO1 mRNA 表达的影响
• 7.1 成骨细胞内HO-1 mRNA 的表达
• 7.2 成骨细胞内 NQO1 mRNA 的表达
• 讨论
• 1 体外成骨细胞的培养
• 2 氟对成骨细胞增殖周期、凋亡的影响
• 3 氟对成骨细胞氧化应激、DNA 损伤的影响
• 4 氟对核转录因子Nrf2 的影响
• 5 氟对成骨细胞Nrf2-ARE 信号通路下游基因表达的影响
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 在校期间科研成绩
• 附录（英文缩略词表）
• 致谢