MnSOD和Catalase在锰氧化过程中作用的初步研究

论文摘要

锰氧化微生物广泛存在于水相和土壤环境中,可高效地将Mn（Ⅱ）氧化成Mn（Ⅳ）,在锰的生物地球化学循环中具有重要的作用。研究发现锰氧化是一个复杂的过程,它包括非生物氧化和生物氧化,其中生物氧化起着主要作用。但是,目前细菌参与的锰生物氧化机理并不十分明确。鉴于此,本研究通过筛选高效锰氧化细菌并对其氧化机理进行探索。从全国各地不同的土样中分离纯化出54株锰氧化细菌,从其中25株高活性菌株中选取5株进行16S rDNA分析,经鉴定3株为蜡样芽胞杆菌,1株为短小芽胞杆菌,1株为巨大芽胞杆菌。另外选取实验室保藏的18株苏云金芽胞杆菌进行锰氧化率的测定,发现有7株菌锰氧化活力比筛选的菌株还要高,因此选取一株高锰氧化菌株Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus HD-9进行机理研究。将HD-9发酵液上清经0.22μm无菌微孔滤膜过滤后进行Native-PAGE胶活性分析,将目的条带进行质谱分析,结果与数据库中B. thuringiensis serovar konkukianstr.97-27中过氧化氢酶（CAT）匹配,另外根据文献报道推测锰超氧化物歧化酶（MnSOD）与锰氧化相关,因此扩增B. thuringiensis 97-27中MnSOD和CAT对应的基因sodA和katB,构建原核表达载体分别在大肠杆菌BL21（DE3）中表达纯化,同时分别构建芽胞杆菌表达载体在B. thuringiensis BMB171中表达。通过在体外测定MnSOD和CAT的锰氧化活性,发现CAT能直接氧化锰,但锰氧化效率并不高；而MnSOD不能直接氧化锰,但是使用两种酶共同作用时,锰氧化率比单独用CAT作用低；而且表达重组菌株锰氧化率较BMB171有一定的降低。HD-9的发酵液上清经0.22μm无菌微孔滤膜过滤经高温处理后,再分别用MnSOD或CAT处理,锰氧化率增加,但同时用MnSOD和CAT处理时,其锰氧化率反而相对降低,说明这两种酶均在锰氧化过程起一定作用。本研究首次利用微量热仪研究MnSOD表达与Mn（Ⅱ）氧化之间的作用,研究发现sodA在E. coli BL21（DE3）中表达的情况下,加入2.0 mmol/L Mn2+前后其微量热参数有明显的变化,也说明MnSOD酶在锰氧化中发挥一定作用,为细菌锰氧化机理的研究提供一定的依据,对揭示锰氧化相关酶的作用机理方面有着重要的意义。

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摘要

ABSTRACT

缩略语表

1 前言

1.1 细菌锰氧化机制的研究

1.1.1 锰氧化细菌及模式菌株

1.1.2 细菌锰氧化机理

1.1.3 细菌锰氧化相关的酶及氧化因子

1.2 利用微量热技术研究锰氧化机理

1.3 本课题研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 培养基和试剂的配制

2.2 试剂

2.3 实验器材

2.4 筛选及鉴定锰氧化细菌的方法

2.4.1 锰氧化细菌的初筛

2.4.2 具有锰氧化活性菌株的摇瓶复筛

2+的氧化的检测方法'>2.4.3 锰氧化菌对Mn²⁺的氧化的检测方法

2.4.4 分离菌株的16S rDNA的扩增与序列测定及结果分析

2.5 分子克隆方法

2.5.1 质粒抽提

2.5.2 总DNA抽提

2.5.3 目的片段的PCR扩增

2.5.4 PCR纯化以及切胶回收

2.5.5 酶切

2.5.6 连接反应

2.5.7 转化感受态细胞

2.5.8 转化子验证

2.5.9 序列测定与比对

2.5.10 实验菌株及质粒

2.6 菌种培养与蛋白纯化

2.6.1 菌种培养

2.6.2 Ni-NTA亲和纯化

2.6.3 蛋白含量测定

2.6.4 常规SDS-PAGE分析

2.6.5 酶活测定方法

2.7 HD-9发酵液上清液的收集步骤及上清液锰氧化

2.8 Native-PAGE胶锰染和LBB染色处理

2.9 纯化酶体外锰氧化活性的测定方法

2+的氧化'>2.10 无锰培养发酵液过滤上清液经各种处理后对Mn²⁺的氧化

2.11 微量热仪测定方法

3 结果与分析

3.1 锰氧化细菌的分离与筛选结果

3.2 分离菌株的16S rDNA的鉴定

3.3. HD-9发酵液上清中锰氧化酶的分析

3.3.1 HD-9发酵液上清中锰氧化率分析

3.3.2 HD-9发酵液上清Native-PAGE胶活性分析

3.4 sodA和katB基因的扩增、表达和纯化及酶活的测定

3.4.1 sodA和katB基因的扩增

3.4.2 sodA和katB基因在大肠杆菌表达载体的构建

3.4.3 重组MnSOD和CAT的表达及纯化及酶活的测定

3.5 sodA和katB在苏云金芽胞杆菌中过表达重组菌株的构建

3.5.1 sodA基因过表达重组菌的构建

3.5.2 katB基因表达重组菌的构建

3.6 sodA和katB在苏云金芽胞杆菌表达重组菌株的锰氧化率测定

3.7 纯化的MnSOD和CAT体外锰氧化率的测定

2+的氧化率的测定'>3.8 HD-9过滤上清液经各种处理后对Mn²⁺的氧化率的测定

2+的微量热分析'>3.9 MnSOD重组菌氧化Mn²⁺的微量热分析

2+的微量热分析'>3.9.1 HD-9菌株在不同浓度Mn²⁺的微量热分析

3.9.2 大肠杆菌BL21（DE3）的微量热分析

3.9.3 在Mn（Ⅱ）条件下MnSOD表达对重组菌生长代谢作用微量热分析

4 讨论

4.1 锰氧化细菌中的芽胞杆菌

4.2 锰氧化蛋白的分离鉴定、表达纯化及活性分析

4.3 微量热方法分析MnSOD对锰的氧化作用

5 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

致谢

MnSOD和Catalase在锰氧化过程中作用的初步研究

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