芒果果实潜伏侵染、Botryodiplodia theobromae致腐机理及蒂腐病防治技术基础研究

论文摘要

芒果（Mangifera indica L.）是一种重要的热带亚热带水果,芒果产业已构成我国热区农业和农村经济的重要组成部分,在热区农业产业结构调整中发挥着积极的作用。然而,芒果采后病害严重制约着芒果产业的发展。由于引起芒果采后病害的病原菌大多具有潜伏侵染的特性,导致果实在贮运及销售过程中快速、严重腐烂,其中,由可可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae Pat.）等引起的蒂腐病在果实尚未成熟即开始造成腐烂,是引起芒果采后腐烂的重要病原菌。本文以可可球二孢菌（B. theobromae）等蒂腐病病菌和芒果互作为研究对象,开展芒果果实真菌潜伏侵染、B. theobromae在果实致病过程中的作用机理、B. theobromae对常用杀菌剂的抗性及其引起的采后病害防治技术等研究,旨在摸清我国芒果果实中的潜伏侵染真菌种类及严重程度,初步阐明B. theobromae致芒果果实快速腐烂的机理,探讨B. theobromae的抗药性水平及蒂腐病的安全、有效的采后处理方法,为研发芒果蒂腐病的防治措施提供依据。本研究采用组织分离法对采自我国6省区的芒果果实潜伏侵染真菌进行检测与种类鉴定,研究结果表明：在芒果果实中普遍存在真菌的潜伏侵染现象。不同省区的带菌率存在显著差异（F=3.59,P=0.0246）。不同年份的带菌率略有差异,但未达到显著差异水平（F=1.57,P=0.2372）。果实不同部位的带菌率间存在极显著差异（F=46.44,P<0.0001）,果柄和果实蒂部的带菌率极显著高于果实中部和端部的带菌率。鉴定的潜伏侵染真菌有11种,分别为Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Penz.&Sacc.、 Botryodiplodia theobromae Pat.、Colletotrichum acutatum Simmonds、Phomopsis mangiferae Ahmad.、Pestalotiopsis mangiferae （P. Henn.） Sutton.、Dothiorella dominicana Pet. et Cif.、 Macrophoma mangiferae Hing.、O. P. Sharma、Alternaria alternata （Fr.） Keissl.、 Aspergillus sp.、Curvularia sp.和Fusarrium spp.,其中,C. gloeosporioides和B. theobromae为芒果果实中的主要潜伏侵染真菌,M. mangiferae在芒果果实上作为潜伏侵染真菌为首次报道,B. theobromae为致病力最强的潜伏侵染真菌。B. theobromae、C. gloeosporioides、D. dominicana和P. mangiferae4种芒果主要蒂腐病菌的致病力存在极显著差异,其中B. theobromae的致病力最强,B. theobromae在含果胶和纤维素的培养基上的生长速度均极显著高于其他3种蒂腐病菌的生长速度,采用刚果红平板水解圈法测定的结果表明,该菌产生的果胶酶活性极显著高于其他3种蒂腐病菌的果胶酶活性；纤维素酶活性虽与C. gloeosporioides无显著差异,但极显著高于D. dominicana和P. mangiferae的纤维素酶活性。采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定的结果表明,B. theobromae在离体培养条件下或接种与芒果果实上均可产生多聚半乳糖醛酸酶（PG）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）、多聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、果胶甲基反式消除酶（PMTE）,以及纤维素酶（Cx）。其中PG、PMG和Cx活性较高,PGTE和PMTE活性很低。在大量产生的3种细胞壁降解酶中,其中PG活性最大,且峰值在早期出现。B. theobromae在液体培养基中可产生导致芒果嫩叶褐变、嫩枝萎蔫和果实腐烂的致病毒素。该毒素在酸性至中性条件稳定,热稳定性强,对光照不敏感,低温条件更有利于毒素的保存。B. theobromae在离体条件下可产生乙烯；接种到芒果果实上,在芒果果实内可诱导芒果果肉产生大量的1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）,从而诱导芒果果实快速释放乙烯。自然条件下发生蒂腐病的果实,在症状出现前1-2d,其乙烯释放速率即开始升高,并随着病程的发展,乙烯释放速率显著增强,且3-5d内,发病果实软化、腐烂。B. theobromae群体中存在着对多菌灵抗性的群体。采用生长速率法进行了23种杀菌剂对4株对多菌灵抗性差异的B. theobromae的毒力测定,通过EC50值、EC90值及与多菌灵的交互抗性等的综合分析,认为咪鲜胺锰盐、咪鲜胺、丙环唑、苯醚甲环唑、氟硅唑、异菌脲、戊唑醇、腈菌唑、吡唑醚菌酯、井冈霉素,以及百菌清和代森锰锌可用作芒果蒂腐病防治的杀菌剂。B. theobromae除对多菌灵产生抗性外,还对甲基硫菌灵、噻菌灵、醚菌酯和烯唑醇4种杀菌剂产生了抗药性。通过交互抗性分析,多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵和烯唑醇4种杀菌剂之间存在交互抗性,而醚菌酯与井冈霉素之间存在负交互抗性。异菌脲、咪鲜胺和咪鲜胺·异菌脲3种杀菌剂对芒果蒂腐病具有较好的防效,而咪鲜胺·异菌脲、咪鲜胺对芒果炭疽病的防效达93%以上。根据对芒果蒂腐病和炭疽病防治效果的综合评价,咪鲜胺·异菌脲对控制芒果采后病害的效果最好,其次是咪鲜胺。供试的18种食品添加剂对C. gloeosporioidesS、C. gloeosporioidesR、B.theobromaesS、 B. theobromaeR、P. mangiferae和D. dominicana6种芒果采后病害病原菌的毒力存在极显著差异,邻苯基苯酚钠对6种病原菌的平均ECso值和平均EC90值均最小,分别为7.21μg/mL和39.53μg/mL,其次是脱氢乙酸钠和阿魏酸。脱氢乙酸钠对炭疽病和蒂腐病的防效最好,防效分别达到83.52%和59.32%,其次阿魏酸和肉桂醛。阿魏酸处理的果实贮藏时间最长,平均贮藏时间达15.51d,其次是脱氢乙酸钠和甘草抗氧化剂,而毒力最大的邻苯基苯酚钠对芒果果实造成伤害。使用食品添加剂结合壳聚糖的复合涂膜技术,可显著提高对蒂腐病的防治效果,1000μg/mL脱氢乙酸钠+1.5%壳聚糖涂膜与1000μg/mL阿魏酸+1.5%壳聚糖涂膜,对蒂腐病的防效分别达到99.34%和96.97%,500μg/mL脱氢乙酸钠+1.5%壳聚糖的防效达到90.28%。食品添加剂的复合涂膜技术不仅提高了对芒果蒂腐病的防治效果,还可显著降低杀菌剂的使用,且不存在农药残留问题,是一种值得推广应用的采后处理方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 芒果采后病害研究综述
• 1 芒果生产现状
• 2 芒果采后损失严重制约了芒果产业的发展
• 3 芒果采后病害为害、病原、流行学与防治
• 4 芒果果实真菌潜伏侵染与采后病害爆发
• 第二章 潜伏侵染是病原菌与寄主协同进化的结果
• 1 潜伏侵染的定义
• 2 潜伏侵染是病原菌和寄主协同进化的结果
• 3 病原菌的潜伏侵染结构及其在寄主上的潜伏侵染部位
• 4 病原菌潜伏侵染的生理机制
• 5 病原菌潜伏侵染的确定
• 第三章 植物病原菌致病机理研究
• 1 细胞壁降解酶在植物病原菌侵染中的作用
• 1.1 细胞壁降解酶的类型
• 1.2 细胞壁降解酶在植物病原菌侵染中的作用
• 1.2.1 是病原菌侵染的致病因子
• 1.2.2 是植物抗病反应的诱导因子
• 1.3 影响细胞避降解酶产生的因素
• 2 植物病原毒素在植物病原菌侵染中的作用
• 2.1 植物病原毒素的定义与分类
• 2.2 植物病原毒素的致病机理
• 2.2.1 植物病原真菌毒素的作用位点
• 2.2.2 病原真菌毒素的作用方式
• 2.2.3 对寄主生理代谢的影响
• 2.3 植物病原菌毒素的应用
• 3 乙烯在寄主--病原菌互作过程中的作用
• 3.1 乙烯诱导并参与植物对病原菌的防御反应
• 3.2 乙烯积累与不同类型“植物-病原菌”互作的关系
• 3.3 受乙烯诱导的抗病相关基因
• 第四章 果蔬采后病害控制技术研究进展
• 1 低温贮藏
• 2 气调贮藏
• 3 热处理
• 4 化学防治
• 4.1 植物病原真菌对内吸性杀菌剂的抗性
• 4.2 交互抗药性
• 4.3 影响病原真菌抗药性的因素
• 4.4 病原菌抗药性的综合治理
• 4.4.1 治理策略
• 4.4.2 合理用药延缓抗药性的发展
• 4.4.3 发展混配剂是解决病原真菌抗药性的有效途径
• 4.4.4 研发并推广应用具有多作用位点、低抗性风险、无交互抗性的新型杀剂
• 4.4.5 抗性资源的利用
• 4.4.6 开发生物防治等防治手段
• 5 生物防治技术
• 5.1 微生物的防治
• 5.2 自然抗菌物资的利用
• 5.3 诱导抗性
• 6 其他处理方法
• 第五章 研究目的
• 下篇 研究内容
• 第一章 芒果果实潜伏侵染真菌种类研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 芒果果实带菌率的测定
• 1.2.2 真菌的纯化、保存
• 1.2.3 分离菌株的致病性测定
• 1.2.4 病原菌种类形态学鉴定
• 1.2.5 分子生物学鉴定
• 1.2.5.1 病原菌基因组DNA提取及rDNA-ITS区PCR扩增
• 1.2.5.2 病原菌rDNA-ITS序列克隆与测序
• 2 结果与分析
• 2.1 芒果果实带菌情况分析
• 2.2 致病性分析
• 2.3 致病分离物的鉴定
• 2.3.1 CoG
• 2.3.2 BoT
• 2.3.3 CoA
• 2.3.4 PhM
• 2.3.5 PeM
• 2.3.6 DoD
• 2.3.7 MaM
• 2.3.8 AlA
• 2.3.9 As
• 2.3.10 Cu
• 2.3.11 Fu
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 可可球二孢菌（B.theobromae）的致腐机理研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试病原菌
• 1.1.2 供试培养基
• 1.1.3 供试芒果
• 1.1.4 酶提取液
• 1.1.5 酶反应底物
• 1.1.6 染色剂与显色剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 4种芒果蒂腐病菌致病力测定
• 1.2.2 4种蒂腐病菌产细胞壁降解酶活性的测定
• 1.2.3 可可球二孢菌（B.theobromae）细胞壁降解酶的提取及测定
• 1.2.3.1 在离体培养条件下的细胞壁降解提取
• 1.2.3.2 接种后,果实细胞壁降解酶的提取
• 1.2.4 酶活性测定
• 1.2.5 可可球二孢菌（B.theobromae）粗毒素的制备与生物活性测定
• 1.2.5.1 粗毒素的制备
• 1.2.5.2 采用嫩叶进行生物活性测定
• 1.2.5.3 采用枝条进行生物活性测定
• 1.2.5.4 采用果实进行生物活性测定
• 1.2.6 可可球二孢菌（B.theobromae）粗毒素理化性质研究
• 1.2.6.1 pH值稳定性研究
• 1.2.6.2 热稳定性研究
• 1.2.6.3 光稳定性研究
• 1.2.6.4 贮藏性研究
• 1.2.7 可可球二孢菌（B.theobromae）释放乙烯的研究
• 1.2.7.1 离体条件下,可可球二孢菌（B.theobromae）释放乙烯的研究
• 1.2.7.2 自然发病果实释放乙烯的研究
• 1.2.7.3 果实不同发病级别对释放乙烯的影响
• 1.2.7.4 接种B.theobromae后,芒果果实释放乙烯的研究
• 1.2.7.5 果肉中1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）含量测定
• 2 结果与分析
• 2.1 可可球二孢菌（B.theobromae）细胞壁降解酶对芒果果实的致病作用
• 2.1.1 4种芒果蒂腐病菌的致病力分析
• 2.1.2 4种蒂腐病菌细胞壁降解酶活性的比较
• 2.1.3 可可球二孢菌（B.theobromae）细胞壁降解酶种类活性比较
• 2.1.4 病程中可可球二孢菌（B.theobromae）产生细胞壁降解酶的活性变化
• 2.2 可可球二孢菌（B.theobromae）毒素的初步研究结果
• 2.2.1 可可球二孢菌（B.theobromae）毒素的生物活性
• 2.2.2 可可球二孢菌（B.theobromae）毒素稳定性研究
• 2.2.2.1 pH值对毒素毒性的影响
• 2.2.2.2 热稳定性
• 2.2.2.3 光照对毒素毒性的影响
• 2.2.2.4 贮藏条件对毒素活性的影响
• 2.3 可可球二孢菌（B.theobromae）对芒果采后乙烯释放的影响
• 2.3.1 离体条件下,可可球二孢菌（B.theobromae）释放乙烯的研究
• 2.3.2 自然发病果实释放乙烯研究
• 2.3.3 不同发病级别对芒果释放乙烯的影响
• 2.3.4 接种可可球二孢菌（B.theobromae）对芒果果肉中ACC含量和果实释放乙烯的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 4.1 可可球二孢菌（B.theobromae）细胞壁降解酶对芒果果实致病作用
• 4.2 可可球二孢菌（B.theobromae）毒素的初步研究
• 4.3 可可球二孢菌（B.theobromae）对芒果采后乙烯释放的影响
• 第三章 芒果蒂腐病的抗药性及防治技术研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试病原菌
• 1.1.2 供试芒果
• 1.1.3 供试杀菌剂
• 1.1.4 供试食品添加剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 可可球二孢菌（B.theobromae）对多菌灵的抗药性
• 1.2.2 23种杀菌剂对抗、感多菌灵的可可球二孢菌（B.theobromae）的毒力
• 1.2.3 采后杀菌剂处理控制蒂腐病的研究
• 1.2.3.1 处理方法
• 1.2.3.2 贮藏期间的病害调查与统计
• 1.2.4 食品添加剂的初筛
• 1.2.5 食品添加剂的毒力测定
• 1.2.6 食品添加剂对芒果病害防治效果及贮藏时间的研究
• 1.2.7 食品添加剂的涂膜技术研究
• 1.2.8 数据统计分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 可可球二孢菌（B.theobromae）对多菌灵的抗药性
• 2.2 23种杀菌剂对抗、感多菌灵的可可球二孢菌（B.theobromae）的毒力
• 2.3 抗多菌灵菌株对22种杀菌剂的交互抗性及抗其它杀菌剂菌株对供试杀菌剂间的交互抗性
• 2.4 杀菌剂处理对蒂腐病控制效果
• 2.5 食品添加剂的初筛结果
• 2.6 食品添加剂的毒力测定结果
• 2.7 食品添加剂对芒果采后病害防治效果及贮藏时间的影响
• 2.8 食品添加剂的涂膜技术研究
• 3 讨论
• 4 小结
• 4.1 对多菌灵的抗药性及杀菌剂筛选
• 4.2 食品添加剂使用技术
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 缩略语
• 作者在读期间科研成果简介
• 致谢