内质网分子伴侣PDI在非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究

论文摘要

研究背景及目的：近年来,随着经济水平的提高,生活方式的改变,非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）已成为我国导致慢性肝病的重要原因之一,其中,非酒精性单纯性脂肪肝是一种良性病变,而非酒精性脂肪性肝炎则会进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等终末期肝病。目前,NAFLD的发病机制尚不明确,已有一些研究表明,肝细胞凋亡是促进其进展的重要病理生理改变,且程度与疾病严重程度呈正相关,但其中的机制仍未完全阐明。研究证实,过度的内质网应激易导致细胞功能障碍及细胞凋亡,而内质网上的分子伴侣或许可以影响此过程。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）是一种定位于内质网管腔的分子伴侣,在NAFLD中PDI是否可影响内质网应激所诱导的细胞凋亡过程,目前尚未见文献报道。本研究旨在通过体外实验的方法,探索PDI在此过程中所起的作用,同时试图阐明其可能的机制。方法：（1）细胞培养和转染：HL-7702细胞用加入了10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,并置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中。传代至状态良好时,消化后铺至12孔板中,按LipofectamineTM 2000说明书进行转染操作。72h后改用1mM FFA高脂培养基继续培养24h。（2）油红O染色：吸去培养基,用PBS轻柔漂洗后加入12%中性甲醛固定15min,然后用油红稀释液染色15min,60%异丙醇漂洗后用苏木素复染5min,显微镜下观察并拍照。（3） Western Blot检测：收集12孔板中的细胞并提取蛋白,将各组蛋白加入相应泳道后进行SDS-PAGE电泳,然后将蛋白转至PVDF膜上,封闭1 h,一抗4℃孵育过夜,再用二抗孵育后行ECL法检测,最后用凝胶成像系统拍照。（4）细胞凋亡检测：细胞用冷的PBS洗两次并重悬后,加入适量的Annexin V和PI染色,混匀后避光孵育15min,孵育后加入1×buffer 400ul,用流式细胞仪完成检测。结果：（1）油红O染色：与对照组相比,FFA脂变诱导组细胞胞浆内可见大量红染的脂滴,但经高脂培养基诱导的三组,即单纯FFA诱导组、PDI-negative siRNA+FFA诱导组及PDI-siRNA Mix+FFA诱导组组间差异不明显。（2）细胞凋亡结果：与对照组相比,单纯FFA诱导组、PDI-negative siRNA+FFA诱导组、PDI-siRNA Mix+FFA诱导组的细胞凋亡比例依次升高。（3）内质网应激及凋亡相关指标：与对照组相比,GRP78在单纯FFA诱导组、PDI-negative siRNA+FFA诱导组及PDI-siRNA Mix+FFA诱导组的表达均增高,并以PDI-siRNA Mix+FFA诱导组增高最明显。而CHOP在对照组、单纯FFA诱导组、PDI-negative siRNA+FFA诱导组及PDI-siRNA Mix+FFA诱导组的表达是依次增高的。另外,IRE1在各组表达情况无明显差异。结论：（1）PDI表达下调能加重内质网应激程度；（2）PDI表达下调能加重由内质网应激诱导的细胞凋亡；（3）在HL-7702细胞中,内质网应激可能主要通过上调CHOP表达诱导细胞凋亡发生；（4） PDI可能不影响细胞发生单纯脂变的过程。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 插图和附表清单
• 缩略语表
• 目次
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果
• 3.1 脂肪变细胞模型的构建
• 3.2 四对PDI-siRNA敲低效果检测
• 3.3 PDI对细胞脂肪变的影响
• 3.4 流式细胞仪检测凋亡结果
• 3.5 内质网应激及凋亡相关指标检测
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在校期间发表论文