镉对华溪蟹的损伤与低分子量壳聚糖的防护作用

论文摘要

本论文采用了急性镉（Cd2+）染毒的实验方法,分别设置了：空白对照组、3个Cd2+浓度组（29、58、87 mg/L）、3个不同浓度的低分子量壳聚糖（low molecular weight chitosan, LMWC）与Cd2+联合作用组（58 Cd2++20 mg/L LMWC、58 Cd2++40 mg/L LMWC和58 Cd2++80 mg/L LMWC）,经处理96h后,研究对长江华溪蟹（Sinopotamon yangtsekiense）肝胰腺、鳃、心脏和肌肉四种组织的损伤程度。首先,采用2,4-二硝基苯肼（DNPH）比色法测定了组织中蛋白质羰基（protein carboyl, PCO）含量；KC1-SDS沉淀法测定了DNA与蛋白质交联率（DNA-protein crosslinks coefficient, DPC）。其次,就Cd2+对四种组织中一氧化氮（nitric oxide, NO）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）及与钙稳态相关的两种酶Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力的影响及不同浓度LMWC与Cd2+联合作用进行了研究。还有,为了进一步探讨Cd2+致机体毒性作用机理及LMWC对机体的防护作用,采用实时荧光定量PCR方法,测定了四种组织中金属硫蛋白mRNA（MTmRNA）的表达。结果显示：（1）经Cd2+作用后,肝胰腺、鳃、心脏和肌肉四种组织中PCO含量和DPC交联率均呈现升高趋势,其中在58、87mg/L Cd2+作用下,肝胰腺和鳃中PCO含量显著增加,且DPC交联率显著升高；但是心脏和肌肉中两种指标均无显著变化。当LMWC与Cd2+联合作用后,与Cd2+单独作用相比,肝胰腺和鳃组织中PCO含量均显著下降,而心脏和肌肉中的PCO含量变化不显著；肝胰腺、鳃、心脏、肌肉四种组织中DPC都有显著或极显著下降。（2）随着Cd2+浓度增加,肝胰腺和鳃组织中的NO含量显著增加,心脏和肌肉中NO含量无显著变化；当镉浓度58mg/L时,肝胰腺组织中iNOS活力极显著升高,鳃组织iNOS活力显著升高,而心脏和肌肉中iNOS活力变化不显著。当LMWC与Cd2+联合作用后,与Cd2+单独作用相比,在浓度58 mg/L Cd2++80 mg/L LMWC时,肝胰腺、鳃和肌肉组织中NO含量显著下降,而心脏中NO含量变化不显著；iNOS活力变化趋势与NO的变化类似。（3）当Cd2+单独作用时,肝胰腺和鳃组织中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活力显著下降,且当Cd2+浓度58、87mg/L时,鳃中Na+-K+-ATPase的活力有极显著下降,肝胰腺有显著下降,而心脏和肌肉组织变化不显著；Ca2+-ATPase活力变化趋势与Na+-K+-ATPase的变化趋势相同。当LMWC与Cd2+联合作用时,与Cd2+单独作用相比,肝胰腺和鳃组织中Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活力均显著升高,而心脏和肌肉组织中Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活力变化不显著。（4）在较高浓度58 mg/L Cd2+胁迫下,肝胰腺和鳃组织中MT mRNA表达显著升高；肌肉组织在29 mg/L Cd2+时表达显著升高,而心脏组织中的表达在各个剂量组均无显著性变化。与58 mg/L Cd2+单独作用相比,LMWC与Cd2+联合作用,四种组织中MT mRNA的表达呈现下降趋势,其中肝胰腺和鳃组织中MT mRNA的表达下降较显著,而心脏和肌肉中的下降无显著性差异。结论：（1）镉胁迫下,长江华溪蟹四种组织中的PCO含量和DPC均升高,且具有组织差异性；当LMWC与Cd2+联合作用时,PCO含量和DPC减少。LMWC对镉引起的蛋白质氧化损伤有一定保护作用。（2）镉能抑制长江华溪蟹四种组织中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力；在LMWC与镉联合作用下,Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力有一定程度的升高,有助于维持细胞内的钙稳态。（3）镉能使长江华溪蟹四种组织中iNOS活力升高,产生大量NO；在LMWC与镉联合作用下,NO含量和iNOS活力有一定程度的下降,减轻了NO对机体的毒性作用。（4）镉能够诱导长江华溪蟹四种组织中MT mRNA的表达；在LMWC与镉联合作用下,MT mRNA的表达有一定程度的下降,进而起到保护机体的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1 镉的污染现状
• 2 镉毒性作用机理研究进展
• 2.1 镉与蛋白质氧化损伤
• 2.2 镉与钙稳态
• 2.3 镉与金属硫蛋白
• 3 低分子量壳聚糖研究进展
• 3.1 低分子量壳聚糖的性质
• 3.2 低分子量壳聚糖的功能及应用
• 3.2.1 低分子量壳聚糖在农业方面的应用
• 3.2.2 低分子量壳聚糖在医学方面的应用
• 3.2.3 低分子量壳聚糖在环保方面的应用
• 4 本学位论文研究的目的和意义
• 第二章 镉致长江华溪蟹蛋白质氧化损伤和DNA-蛋白质交联率的影响与低分子量壳聚糖的联合作用
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 染毒和样品制备
• 1.3.2 PCO含量测定
• 1.3.3 DPC含量测定
• 1.3.4蛋白质含量测定
• 1.4 统计分析
• 2 结果
• 2.1 镉对长江华溪蟹PCO含量的影响
• 2.2 低分子量壳聚糖对镉致长江华溪蟹PCO含量的作用
• 2.3 镉对长江华溪蟹DPC的影响
• 2.4 低分子量壳聚糖对镉致长江华溪蟹DPC的作用
• 3 讨论
• 第三章 镉对长江华溪蟹金属硫蛋白mRNA表达诱导与低分子量壳聚糖的联合作用
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 染毒处理
• 1.3.2 提取RNA
• 1.3.3 引物与探针
• 1.3.4 MTmRNA表达的测定
• 1.3.5 β-aetin RmNA表达的测定
• 1.4 数据分析
• 2 结果
• 2.1 长江华溪蟹MT与β-actin基因PCR扩增产物
• 2.2 长江华溪蟹MT与β-actin基因实时荧光定量PCR
• 2.3 镉诱导长江华溪蟹四种组织MT mRNA表达的影响
• 2.4 低分子量壳聚糖对镉诱导长江华溪蟹四种组织MT mRNA表达的作用
• 3 讨论
• +-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase的影响与低分子量壳聚糖的联合作用'>第四章 镉对长江华溪蟹Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase的影响与低分子量壳聚糖的联合作用
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 染毒处理
• 2+-ATPase与Na⁺-K⁺-ATPase活力的测定'>1.3.2 Ca²⁺-ATPase与Na⁺-K⁺-ATPase活力的测定
• 1.3.3 蛋白质含量测定
• 1.3.4 数据分析
• 2 结果
• +-K⁺-ATPase活力的影响'>2.1 镉对长江华溪蟹Na⁺-K⁺-ATPase活力的影响
• +-K⁺-ATPase活力的作用'>2.2 低分子量壳聚糖对镉致长江华溪蟹Na⁺-K⁺-ATPase活力的作用
• 2+-ATPase活力的影响'>2.3 镉致长江华溪蟹Ca²⁺-ATPase活力的影响
• 2+-ATPase活力的作用'>2.4 低分子量壳聚糖对镉致长江华溪蟹Ca²⁺-ATPase活力的作用
• 4 讨论
• 第五章 镉对长江华溪蟹NO和iNOS的影响与低分子量壳聚糖的联合作用
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 染毒处理
• 1.3.2 NO与iNOS活力的测定
• 1.3.3 蛋白质含量测定
• 1.3.4 数据分析
• 2 结果
• 2.1 镉对长江华溪蟹NO含量的影响
• 2.2 低分子量壳聚糖对镉致长江华溪蟹NO含量的作用
• 2.3 镉对长江华溪蟹iNOS活力的影响
• 2.4 低分子量壳聚糖对镉致长江华溪蟹iNOS活力的作用
• 3 讨论
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式