Eya1调节Cyclin D1促进乳腺癌细胞增殖的机制研究

论文摘要

第一部分：蛋白Eyal促进乳腺癌细胞增殖目的探讨蛋白Eyal在乳腺癌细胞增殖中的作用。方法选用乳腺癌细胞系MDA-MB-453, SK-BR3, BT474以及MDA-MB-231作为研究对象。首先,在MDA-MB-453, SK-BR3以及BT474细胞系中采用慢病毒感染的方式稳定高表达蛋白Eyal,Eyal磷酸酶突变体Eya1D327A以及相应的空质粒对照；而在MDA-MB-231细胞系中,通过感染Eyal的shRNA（small hairpin RNA）慢病毒,从而获得稳定低表达蛋白Eya1的MDA-MB-231细胞系以及相应的空质粒对照。然后,在以上的高表达或者低表达蛋白Eyal细胞系中,通过MTT,细胞生长曲线,H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法以及细胞克隆形成实验检测Eyal对乳腺癌细胞增殖能力的影响。结果首先,我们在乳腺癌细胞系MDA-MB-453, SK-BR3,BT474成功构建了稳定表达Eyal,Eyal磷酸酶突变体Eya1D327A以及相应的空质粒对照的稳定细胞株。然后,我们通过MTT比色法,细胞生长曲线检测Eyal对细胞增殖的影响。MTT实验结果表明,在MDA-MB-453细胞中,与空质粒对照相比,高表达Eya1后细胞增殖能力是空质粒组的1.5倍,而高表达Eyal磷酸酶突变体EyalD327A组细胞无明显增殖优势。同样,在SK-BR3细胞中,与空质粒对照相比,高表达Eyal后细胞增殖能力是空质粒组的2倍,而高表达Eyal磷酸酶突变体Eya1D327A组细胞无明显增殖优势。MDA-MB-453, SK-BR3细胞生长曲线的结果表明,高表达Eyal组的细胞增殖明显高于对照组和Eyal磷酸酶突变体EyalD327A组。H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入的结果表明,Eya1组的细胞增殖能力大约是对照组的2倍。其次,我们在细胞系MDA-MB-453, SK-BR3, BT474中检测高表达Eyal对细胞克隆形成的影响。结果表明高表达Eyal组细胞克隆的数量大约是对照组的1.5-3倍。最后,我们在MDA-MB-231细胞中低表达Eyal,通过以上方法检测其对细胞的影响MTT和细胞生长曲线结果均表明,低表达Eyal的细胞增殖能力与对照相比大约下降50%；H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入的结果表明,低表达Eyal组的细胞增殖能力大约降低50%。结论蛋白Eyal促进乳腺癌细胞增殖。第二部分：Eyal促进乳腺癌细胞增殖的机制研究目的探讨蛋白Eyal促进乳腺癌细胞增殖的机制。方法在MDA-MB-453细胞中高表达蛋白Eyal,然后通过基因芯片技术筛选出表达水平变化的基因；经分析得到初步的结果后,在乳腺癌细胞系MDA-MB-453, SK-BR3, BT474以及MDA-MB-231中,从mRNA水平和蛋白水平进一步验证基因芯片的结果；然后找出Eyal转录调节的下游基因,通过启动子活性的检测,染色质免疫沉淀（ChIP）等实验确认Eyal转录调节的基因；最后,通过细胞增殖相关实验如MTT,细胞生长曲线及克隆形成等,证实Eya1依赖其转录的下游基因促进乳腺癌细胞增殖。结果基因芯片提示,MDA-MB-453高表达蛋白Eyal后,与细胞周期密切相关的基因Cyclin D1明显增加；在乳腺癌细胞系MDA-MB-453和SK-BR3中,高表达Eya1促进Cyclin D1 mRNA的表达水平增加,而在MDA-MB-231细胞中抑制蛋白Eyal的表达后Cyclin D1的mRNA表达水平相应下降：我们还验证了Eya1和Cyclin D1之间在蛋白水平表达的一致性；然后,通过对Cyclin D1启动子活性的分析表明Eyal增强Cyclin D1的启动子活性；染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实Eyal结合于Cyclin D1的启动子；在乳腺癌细胞系MDA-MB-453和SK-BR3高表达蛋白Eyal促进乳腺癌细胞增殖,但是抑制细胞内源性的Cyclin D1表达能完全抵消蛋白Eya1对细胞增殖的作用；我们还发现蛋白Eya1促进蛋白Sixl的表达,通过免疫沉淀实验证实二者具有相互作用。内源性Sixl的降低后,Eya1促进细胞增殖能力的随之降低。结论蛋白Eyal通过转录调节Cyclin D1促进乳腺癌细胞增殖

论文目录

• 引言
• 参考文献
• 第一部分:蛋白EYA1促进乳腺癌细胞增殖
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分:EYA1促进乳腺癌细胞增殖的机制研究
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 实验常用缓冲液、试剂的配制方法
• 发表论文及会议摘要
• 致谢