论文摘要
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）属于非发酵菌属,广泛的分布于自然界及医疗环境中,是引起医院内感染的重要条件致病菌。β-内酰胺类、喹诺酮类及氨基糖苷类药物是临床常规治疗PA感染的关键药物,然而随着药物的广泛使用,PA逐渐获得了对上述药物的耐药性,进而演化成多重耐药及泛耐药菌株,造成临床抗感染治疗的失败,严重的威胁人类的健康。PA耐药演变机制较为复杂,可以通过多种方式取得对抗菌药物的耐药。首先,PA可以借助其低渗透能力的外膜蛋白、染色体编码的AmpC酶以及主动外排系统的作用而天然表现对某些种类的抗菌药物耐药；其次,PA在天然耐药的基础上不断通过自身基因组突变而达到对抗菌药物的适应性耐药；最后,PA可以通过一些耐药基因水平转移元件的参与直接获取外界耐药基因,迅速演化成耐药菌株,进一步造成耐药范围的扩大及耐药菌株的广泛传播。然而以上几点因素并非孤立存在,而是相互作用共同导致耐药菌株的产生。因此研究PA耐药演变机制,研究耐药传播动力,对于采取恰当的应对措施,延缓耐药菌株的产生具有积极的意义。本研究拟在前期临床分离PA菌株耐药表型监测的基础上,开展获得性耐药分子机制的研究,以期通过耐药表型结合耐药分子来阐明地区间PA耐药演变规律,为耐药菌株临床治疗及控制提供合理的理论基础。方法：1.收集并保存烟台、合肥及镇江地区3所医院临床分离的非重复PA菌株260株；菌株的鉴定采用法国梅里埃公司全自动微生物分析仪或API鉴定系统；药物敏感试验采用K-B纸片法；药物敏感结果统计分析采用WHONET5.0软件；整合子检测采用PCR方法。2. IntI基因检测阳性菌株进一步采用PCR方法扩增可变区,可变区PCR结果一致性条带采用PCR-RFLP（Restriction fragments length polymorphism）分析以确定可变区类型；SCR1基因及其可变区的检测采用PCR方法,并采用PCR-RFLP分析来确定ISCR1基因可变区类型；复合型整合子检测采用PCR mapping方法。对PCR产物进行纯化及回收,送上海英骏生物公司行双向测序,部分PCR产物克隆至pTG-18T质粒进行测序。测序结果进行拼接,拼接结果采用在线BLAST比对分析来确定基因组结构。提取质粒,采用电化至受体菌,通过PCR验证整合子的可转移性。3.对新的p-内酰胺基因变异体blaOXA-251,应用DNAstar、clustal1.8及mega4.0软件对其核苷酸及蛋白质序列进行生物信息学研究,构建进化树分析。将全编码blaoxA-10、blaOXA-251基因克隆至pET-28a表达载体,转化至宿主菌BL21,采用抗性平板进行转化株的筛选。采用琼脂稀释方法检测野生株及转化子对不同种类药物MIC。采用超声波粉碎方法进行粗酶的提取,并通过等电点聚焦电泳检测等电点。结果：1.本次耐药监测的临床菌株主要来自住院患者的痰标本（75%）,科室分布主要集中在ICU（25.4%）、呼吸内科（24.2%）及神经内科（11.5%）等科室。耐药检测结果显示,PA菌株对CTX和SXT耐药率高（>60%）,对IPM和AK耐药率低（<20%）,对PB完全敏感,对其它种类抗菌药物的耐药率由低到高依次为：FEP（20.30%）、TZP（21.5%）、CAZ（22.6%）、ATM（31.9%）、TOB（31.9%）、CFP（38.1%）、 GEN（38.8%）、PRL（41.9%）及CIP（49.2%）。检测123株多重耐药菌株（47%）,其中对p-内酰胺类、氨基糖苷类及喹诺酮类呈多重耐药菌株89株（34.2%）；检出Ⅰ类整合子阳性菌株109株（41.9%）,Ⅱ类整合子4株（1.5%）,未检测出Ⅲ类整合子。发现除PB药物外,Ⅰ类整合子检测阳性菌株对不同种类抗菌药物耐药率显著高于Ⅰ类整合子检测阴性菌株（P<0.01）,此外Ⅰ类整合子检测阳性菌株的多重耐药率也显著高于Ⅰ类整合子检测阴性菌株（x2=5.26,P<0.01）。2.109株intll基因阳性PA菌株有95株有效的扩增出Ⅰ类整合子可变区,其中其中有9株为空整合子类型,有3株为非特异性扩增。发现13种耐药基因盒,分别包括氨基糖苷类类耐药基因（aadA1、aadA2、aadA3、aadA3C、aacA7、aadA13、 aadB）、磺胺类耐药基因（dfrA12）、氯霉素耐药基因（cmlA8）以及β-内酰胺类耐药基因（blaP1、blaOXA-251、blaOXA-10、blaIMP-4）。发现两个新的耐药基因盒：aadA3C和blaOXA-251。aadA3C与aacA3（GenBank:M29695）存在3个核苷酸位点突变,其中两个为无义突变,有一个导致编码氨基酸的突变（Asp85Gly）; blaOXA-251基与其最近的匹配序列blaoxA-lo存在3个核苷酸的突变,分别导致其编码氨基酸的改变：Gly128Asp, Lys137Asn、Ile187。blaOXA-251基因序列递交http://www.lahey.org/Studies网站,获取新的OXA酶编号：OXA-251。发现由耐药基因盒排列组成7种类型整合子排列方式,依据片段结构大小分别为：blaPl、 aacA7、aadB-aadA1、blaVIM-4-blaP1、drfA12-orf-aadA2、aacA3C-aadA13-blaOXA-251、 aacA3-aadA13-clmA8-blaoxA-10。在PA菌株中发现aadB-aadAl和aacA3C-aadA13-blaoxA-251两种新的整合子,获取GenBank号分别为JN157817、 JN118546,其中aacA3C-aadA13-blaoxA-251为一种从未报道的整合子类型,被http://integrall.bio.ua.pt网站命名编号为In713。发现4株Ⅱ类整合子携带同一种耐药基因盒组合,为dfrA1-sat1-aadA1;发现PA菌株同时携带Ⅰ、Ⅱ型整合子,共存方式为blaPl和dfrA1-sat1-aadA1。检测出15株ISCR1基因阳性菌株,PCR-RFLP显示其为同一种类型,序列分析发现其携带blaPER-1、ABC transporter、gst、qacEA基因。采用PCR mapping方法检测出3种类型复合性整合子结构：intll-aacA7-qacEΔ-sul-ISCR1-blaPER-1-gst-ABC transporter-qacEΔ, intIl-aacA3C-aadA13-blaOXA-251-ISCR1-blaPER-1-gst-ABC transporter-qacEΔ和intI-aacA3-aadA13-clmA8-blaoxA-10-ISCR1-blaPER-1-gst-ABC transporter-qacEΔ。采用电转化的方式成功的将含blaP1及drfA12-orf-aadA2整合子的质粒转入感受态的大肠杆菌。3.PCR获取blaOXA-251基因全长804bp,编码266个氨基酸序列。生物信息学分析显示其来自OXA-10酶的突变。成功的构建含blaOXA-10、blaOXA-251转化子,并测其等电点分别为7.1及7.5。药敏结果显示,含blaOXA-251转化子对PRL、CTX、ATM、 CAZ、CFP、FEP、FOX药物的MIC明显高于blaoxA-10转化子菌株,其中对PRLCTX、ATM处于耐药范围,但是对IPM及MEM未发现变化。结论：1.在临床PA菌株中,Ⅰ类整合子最为普遍,且与菌株的耐药及多重耐药密切相关；Ⅱ类整合子比较少见,未发现Ⅲ类整合子。2.PA菌株可以通过整合子介导对p-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素类及甲氧苄啶耐药,并且耐药性可以通过质粒在菌株之间水平传播。3.首次在PA中发现新的耐药基因盒aacA3C和blaOXA-251及新的整合子aadB-aadA1和aacA3C-aadA13-blaOXA-251。这一结果表明,整合子可以借助其自身基因组结构的多样性和灵活性的优势不断的适应外界环境。4.在PA菌株中发现由ISCR1基因元件组成复合型整合子结构,并阐明其在PA耐药形成中的作用。5.成功的克隆并表达了blaOXA-251基因,发现OXA-251酶是起源于OXA-10酶一种新的超广谱OXA酶。