论文摘要
研究背景帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种常见于中老年人的进行性的中枢神经系统变性疾病。最新研究表明,在60岁以上的人口中PD的患病率约为1%,且患病危险性有随着年龄增长而增加的趋势。目前全球有400万PD患者,而在中国就有170万。世界卫生组织预测2050年全球60岁以上人口将增加三倍,据此估计到时PD患者将达1500万以上。PD不仅影响病人的生存质量,而且还给家庭和社会造成巨大的精神和经济负担。因此, PD病的防治已成为不容忽视的社会公共卫生问题。目前PD病因未明,亦无根治办法。PD的药物治疗还只能在多巴胺（Dopamine,DA）代谢水平上进行对症治疗,主要药物左旋多巴不能阻止疾病的进展,还可在25年内引起严重的运动障碍等并发症。因此,探索新的治疗方法迫在眉睫。目前PD的治疗研究包括神经营养因子、基因治疗、神经干细胞移植、抗体与疫苗和中医药等。在疾病的各种防治手段中,免疫治疗是一种方便经济的方法。其中疫苗的应用范围日益扩大,神经变性疾病的疫苗治疗已成为当今的研究热点。疫苗治疗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的研究方兴未艾,而PD的疫苗研究还处在初级阶段。Benner等首先在PD的疫苗治疗方面作出了探索,用Cop-1免疫脾细胞进行过继性转移,对DA能神经元有保护作用。Masliah等用重组人类α-syn蛋白接种转基因小鼠,产生了特异性的神经保护作用。免疫接种后可产生高亲和力、高滴度的抗体,能识别人类α-syn的C末端表位;通过溶酶体途径清除异常的α-syn蛋白,减少α-syn蛋白在DA能神经元和突触的聚集。这些研究表明选择相关抗原免疫或制备相关抗体治疗可能是PD治疗的突破口之一。PD的主要病理改变是黑质致密部DA能神经元严重缺失,DA明显减少;在残存的神经元内出现Lewy小体。Lewy小体是PD的病理标志物,由多种蛋白异常蓄积所致,主要有α-syn、泛素、Parkin、14-3-3蛋白和synphilin-1等,其中α-syn蛋白是Lewy小体的主要构成成分。研究发现这几种蛋白和PD的发病都有关系,而α-syn蛋白的异常改变起着关键作用。因此,α-syn蛋白是非常有希望的治疗靶点。但研究发现主动免疫可能会激发有害的炎症反应。Aβ1-42免疫治疗在动物模型上取得了成功,在临床试验中却意外地出现了中枢神经系统炎症反应和卒中,临床试验因此被迫终止。研究认为这种炎症反应与细胞免疫激活有关,重组α-syn疫苗同样可能遇到这个问题。但免疫佐剂的发展又给疫苗研究带来了新的希望,尤其是核酸疫苗有着丰富的免疫佐剂可供选择。免疫佐剂能增强免疫原性或改变免疫反应类型。核酸疫苗的免疫佐剂包括细胞因子、非甲基化胞苷酸鸟苷、共刺激分子等核酸片段,如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、GM-CSF等。其中IL-10能使细胞免疫向体液免疫转化,还可抑制炎症反应。现已开展了多种神经变性疾病的核酸疫苗研究,但至今无PD的相关研究。构建核酸疫苗,探索核酸疫苗的免疫原性、疫苗免疫类型的调控及中枢神经系统炎症反应的规避,对PD与相关神经变性疾病的预防和治疗都有重要意义。研究目的采用基因工程技术扩增人类α-syn基因和IL-10基因,构建表达人类α-syn蛋白的核酸疫苗,接种PD小鼠模型,观察核酸疫苗对体液免疫的诱导和对PD小鼠中枢神经系统的保护作用,为开发PD的核酸疫苗提供理论和实验依据。方法1.重组质粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10的构建和表达用RT-PCR方法从人胚脑组织扩增人类α-syn基因,从人淋巴细胞扩增IL-10基因。将人类α-syn基因克隆到pVAX1质粒上构建重组质粒pVAX1-hαS140,融合IL-10基因和α-syn基因构建融合质粒pVAX1- hαS140-IL-10。进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。用重组质粒转化大肠杆菌DH5α,抽提质粒,检测合格后转染COS-7细胞,用Western blot法检测其生物学活性。2.核酸疫苗对体液免疫的诱导大量制备pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10两种重组质粒和空质粒pVAX1。分别用重组质粒pVAX1-hαS140和pVAX1-hαS140-IL-10免疫正常的C57BL/6小鼠。采用肌肉注射,100μg/只/次,每三周加强免疫一次,共加强免疫5次。在初次免疫当天和在每次免疫后二周各采血一次,分离血清用于抗体测定。用免疫后的小鼠血清和能表达α-syn的小鼠脑组织行免疫组化反应及中和反应,观察免疫血清抗体的特异性。3.核酸疫苗的免疫保护作用观察用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine,MPTP）多次皮下注射正常的C57BL/6小鼠,5w后接种核酸疫苗,加强免疫3次,具体方法同前。观察DA能细胞的酪氨酸羟化酶和α-syn蛋白的表达水平,比较pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140- IL-10免疫的保护效果。结果1.重组质粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10的构建和表达成功扩增人类α-syn和IL-10基因,并克隆到表达载体pVAX1上,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序,表明重组质粒大小、方向和序列完全正确,成功构建重组质粒pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10,并在哺乳动物细胞COS-7中得到有效表达,经Western blot检测具有较好的生物学活性。2.核酸疫苗对体液免疫的诱导大量制备核酸疫苗pVAX1-hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10和空质粒pVAX1,纯度高,产量大。核酸疫苗免疫的动物血清有较高的抗体滴度,pVAX1-hαS140-IL-10组（3.591±0.54）×103,pVAX1-hαS140组（1.29±0.65）×103 （p<0.01）。核酸疫苗免疫的小鼠血清和能和α-syn过表达的小鼠脑组织发生特异性的免疫组化反应,被α-syn蛋白中和的血清则不发生反应。3.核酸疫苗的免疫保护作用观察核酸疫苗pVAX1-hαS140组、pVAX1-hαS140-IL-10组与空质粒pVAX1组比较,都有较好的免疫效果,p<0.01,有差异显著性。pVAX1-hαS140组与pVAX1-hαS140-IL-10组比较, 0.01<p<0.05,差异显著性,pVAX1- hαS140-IL-10优于pVAX1-hαS140。结论1.本研究成功构建了pVAX1- hαS140、pVAX1-hαS140-IL-10两种真核表达质粒,具有较好的生物学活性。2.核酸疫苗免疫后的小鼠产生较高的抗体滴度, pVAX1- hαS140-IL-10组抗体滴度高于pVAX1- hαS140组。3.核酸疫苗免疫可清除PD慢性小鼠模型脑内异常聚积的α-syn,从而减轻了过表达的α-syn对神经细胞的损害。pVAX1-hαS140-IL-10较pVAX1-hαS140有更好的保护效果。以人类α-syn为靶抗原的核酸疫苗是PD潜在的预防和治疗手段。