华南虎保护遗传学研究

论文摘要

虎（Panthera tigris）有8个亚种，分别为华南虎（P．t．amoyensis，South China tiger）、东北虎（P．t．altaica，Amur tiger）、印支虎（P．t．corbetti，IndoChinese tiger）、孟加拉虎（P．t．tigris，Bengal tiger）、苏门答腊虎（P．t．sumatrae，Sumatran tiger）、巴厘虎（P．t．balica，Bali tiger）、爪哇虎（P．t．sondaica，Javan tiger）和里海虎（P．t．virgata，Caspian tiger），其中华南虎为中国所特有。华南虎分布范围曾东西超过2000公里、南北超过1500公里；地理分布范围位居世界虎分布中心，其东北方向与东北虎分布区相接，西南与印支虎、孟加拉虎和苏门答腊虎辐射相邻。然而，因森林砍伐、荒山开垦及上世纪50至60年代的大量捕杀等因素影响，目前野生华南虎已濒临灭绝边缘。 我国现有的圈养华南虎是6只奠基者的后代，按照血缘关系可划为两支；其中“黔系”祖宗为“一雄二雌”，源自贵州野外；“沪系”祖宗则为源自贵州野外的“一雄一雌”与源自福建野外的一雌性奠基者；两支于八十年代中期汇合繁衍。目前圈养华南虎高度近交，遗传多样性急速下降，种群数量和质量持续下降，状况处于Mace-Lancle标准的临界状态；另外，因历史原因，华南虎可能曾与其它亚种虎发生过杂交，外源基因的渗入可能已影响到华南虎基因库的组成结构。因此，开展华南虎保护遗传学研究已十分必要，它对圈养种群繁育、遗传管理及种群的健康发展和保护具有极其重要的指导意义。 本项目采用分子标记对华南虎遗传背景进行研究，主要目的在于：1)掌握华南虎圈养种群遗传结构；2)建立华南虎亲子鉴定方法，进一步澄清圈养种群亲子关系，以便对现有谱系进行核查并进而指导繁育计划；3)评估华南虎圈养群体内遗传变异水平；4)收集和保存华南虎基因资源。 研究结果主要有： 1．采集了51只华南虎的血液、毛发、粪便及上皮组织等样品并提取DNA，初步建立了华南虎基因资源库，及时保存了有关基因资源并为将来利用相关技术来拯救这一物种奠定了基础。 2．应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针与华南虎基因组酶切片段杂交，捕获400—600 bp含有微卫星序列的DNA片段，连接到pGEM-T载体中，构建富集微卫星序列的小片段插入文库，从1440个转化子中获得了257个阳性克隆，成功设计了具有多态性的华南虎微卫星引物20对。 3．应用新获得的20个华南虎微卫星标记在ABI 373 A型测序仪上对51只华南虎进行基因分型。共检测到163个等位基因，平均每个基因座有8.15个等位基因；有效等位基因数1.900-7.378，平均为4.203；稀有等位基因数较多，平均每个基因座有43.6％，只有1个座位（tiger 4）没有稀有等位基因。20个微卫星基因座的期望杂合度He为0.401-0.883，观察杂合度Ho为0.333-0.977，除基

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1 虎生活习性
• 2 虎相关疾病研究
• 3 华南虎与东北虎
• 4 华南虎分布
• 5 野生华南虎种群数量
• 6 华南虎保护
• 7 华南虎其它相关研究
• 7.1 圈养种群管理
• 7.2 虎物种特异性鉴定
• 7.3 虎 SOX基因家族
• 7.4 系统进化分析
• 7.5 其它
• 8 华南虎研究和保护展望
• 第二章 本研究的提出和研究内容
• 1 研究背景
• 1.1 圈养华南虎的生存危机
• 1.2 野生华南虎资源
• 2 研究方案和研究内容
• 2.1 应用微卫星标记进行亲子鉴定和种群遗传结构分析
• 2.2 应用线粒体标记进行华南虎系统进化和分类研究
• 3 研究技术路线和研究方法
• 3.1 全面搜集和整理现存华南虎资料
• 3.2 建立华南虎样品库
• 3.3 应用Dynal磁珠富集技术筛选华南虎微卫星高变异序列
• 3.4 借助微卫星标记和线粒体标记进行检测和参数估计
• 3.5 综合分析研究
• 第三章 华南虎基因资源库的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 药品和器具
• 1.1.1 药品试剂
• 1.1.2 器材
• 1.2 华南虎采样调查内容
• 2 结果与分析
• 2.1 华南虎组织样品库建立
• 2.2 华南虎DNA的提取与保存
• 3 讨论
• 3.1 华南虎资源保存的必要性
• 3.2 华南虎基因资源库建立技术问题
• 3.2.1 组织样品库
• 3.2.2 基因资源数据库
• 第四章 华南虎微卫星方法建立和探针设计
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 华南虎基因组 DNA的提取与回收
• 1.2.2 用Dynal磁珠富集微卫星片段
• 1.2.3 构建富集微卫星小片段插入文库
• 1.2.4 微卫星阳性克隆筛选
• 1.2.5 微卫星序列鉴定和引物设计
• 1.2.6 微卫星标记的多态性检测
• 2 结果
• 2.1 富集文库筛选
• 2.2 阳性克隆数
• 2.3 微卫星 DNA序列分析
• 2.4 微卫星引物的多态性
• 3 讨论
• 第五章 华南虎遗传多样性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 样品采集
• 1.2.1 粪便与毛发采集
• 1.2.2 血样采集
• 1.2.3 组织样采集
• 1.2.4 口腔上皮细胞采集
• 1.3 DNA提取
• 1.4 PCR扩增
• 1.5 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 20 个华南虎多态性微卫星位点的等位基因大小及数量
• 2.2 20 个华南虎多态性微卫星位点的基因型和等位基因频率
• 2.3 Hardy-Weinberg平衡检验
• 2.4 基因杂合度
• 2.5 多态信息含量
• 2.6 有效等位基因数
• 3 讨论
• 3.1 华南虎等位基因数量
• 3.2 华南虎基因杂合度
• 3.3 华南虎等位基因频率分布
• 第六章 华南虎亲子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA提取
• 1.3 PCR反应
• 1.4 亲子鉴定分析
• 2 结果与分析
• 2.1 父亲鉴定排除概率
• 2.2 父亲鉴定的置信度
• 3 讨论
• 第七章 虎细胞核中线粒体序列（NUMT）的发现及其应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源和总DNA提取
• 1.2 线粒体分离
• 1.3 线粒体 DNA提取
• 1.4 PCR扩增
• 1.5 产物回收和测序
• 1.6 重组质粒的PCR鉴定
• 1.7 序列分析及进化树构建
• 2 结果与分析
• 2.1 目的序列扩增
• 2.2 重组克隆鉴定
• 2.3 序列分析
• 2.4 Blast同源搜索
• 2.5 系统进化树分析
• 3 讨论
• 3.1 似D-loop的核中线粒体序列的发现
• 3.2 Numt的应用
• 3.3 估计 Numt的转移时间
• 第八章 华南虎、东北虎及孟加拉虎系统进化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源和总DNA提取
• 1.2 PCR扩增
• 1.3 产物回收和测序
• 1.4 系统进化树
• 2 结果与分析
• 2.1 D-loop
• 2.2 NO5
• 2.3 系统进化树
• 3 讨论
• 3.1 D-loop和 NO5在虎类研究中的适用性
• 3.2 华南虎、东北虎与孟加拉虎之间的进化关系
• 第九章 华南虎种群管理和保护策略研究
• 1 种群管理
• 1.1 影响遗传多样性保护的因素
• 1.1.1 近交衰退
• 1.1.2 遗传漂变、奠基者与系谱瓶颈
• 1.1.3 种群大小和保护时间
• 1.1.4 种群结构
• 1.2 遗传分析
• 1.2.1 莫基者
• 1.2.2 存活个体遗传重要性
• 1.2.3 近交系数
• 1.2.4 有效种群大小
• 1.3 种群结构分析
• 1.3.1 种群增长率
• 1.3.2 年龄/性别结构
• 1.3.3 繁殖率
• 1.3.4 种群承载力
• 2 圈养华南虎保护策略研究
• 2.1 系谱管理
• 2.1.1 数据收集
• 2.1.2 编制系谱
• 2.1.3 亲子鉴定
• 2.2 扩张种群规模
• 2.3 适当延长世代间隔
• 2.4 按照种群结构和亲缘系数安排配对，减少基因丢失
• 2.4.1 确定奠基者贡献指标
• 2.4.2 依据奠基者遗传贡献指标提出每只华南虎的繁育指标
• 2.4.3 依据种群年度增长目标提出每只华南虎的配种建议
• 2.4.4 依据配种建议制定配种计划
• 2.5 充分应用各种繁殖技术
• 2.6 统一管理、加强协作
• 第十章 结论
• 参考文献
• 博士期间进行的研究课题
• 致谢