褶纹冠蚌过氧化氢酶基因克隆、原核表达及酶活性分析

论文摘要

褶纹冠蚌（Crist aria plicata）是我国重要“淡水育珠蚌”之一,近年来褶纹冠蚌频繁受到病害的影响,对其育珠能力产生了极大的影响。本文对褶纹冠蚌过氧化氢酶（cpCAT）的cDNA进行了克隆与原核表达。本文利用RACE-PCR及同源克隆方法,克隆出cpCAT cDNA全长。该基因全长为4863 bp,且有3个外显子,2个内含子。cpCAT cDNA全长为2618 bp,其中编码区1503 bp,5’端不翻译区136 bp,3’端不翻译区979 bp,具有典型的腺苷酸信号序列AATAAA和PolyA尾。该基因序列开放阅读框编码为501个氨基酸,预测蛋白质分子量为56.86kDa,等电点为6.77。BLAST分析显示cpCAT氨基酸序列和动物,植物,细菌的CAT基因有很高的同源性。cpCAT无信号肽,存在过氧化氢酶近端活性位点（61FNRERIPERVVHAKGAG77）和过氧化氢酶近端血红素配体签名序列（351RLYSYSDTH359）,两个糖基化位点（145NNTP148）与（436NFSQ439）。系统发育树结果表明褶纹冠蚌与栉孔扇贝（Chlamys farreri）过氧化氢酶基因的亲缘关系最近。利用RT-PCR分析检测cpCAT基因经注射嗜水气单胞菌后的表达情况,结果表明在注射嗜水气单胞菌后,在血液、鳃、外套膜、闭壳肌和肝脏中都有表达,且在肝脏中的表达量最高,且各个组织中cpCAT基因的表达明显增加,12h后达到最大值,随后表达有所下降,到48h后恢复至原有水平。结果表明褶纹冠蚌在受到病害后,其体内的过氧化氢酶具有防御作用。根据开放阅读框设计带酶切位点（KpnI和EcoRI）的引物,构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE分析表达产物。结果表明重组cpCAT在大肠杆菌（Escherichia coli） Rosetta-gami （DE3）中获得了表达,产物为56.86 KDa。纯化的cpCAT的酶活力可达11194.4+40.4U/mg,该酶最适温度为25℃,有较高的热稳定性（60℃以下）,cpCAT的pH值的最适范围在pH5.0-10.0,最适pH值为7.0。用变性剂Urea和SDS处理时酶活性有所改变,用1%～3%SDS和2～4mol/L Urea处理时,酶活性保持80%以上。随着变性剂浓度的增加,cpCAT酶活力逐渐降低。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 贝类的免疫学研究
• 1.1 贝类的细胞免疫
• 1.2 贝类的体液免疫
• 1.2.1 氧化酶类和抗氧化酶类
• 1.2.2 水解酶类
• 1.2.3 抗菌肽
• 1.2.4 凝集素
• 1.2.5 硝酸盐超氧化物阴离子
• 1.2.6 溶血素
• 2 过氧化氢酶基因
• 2.1 CAT基因的种类和分布
• 2.2 CAT基因结构特点和功能
• 2.3 CAT基因的应用
• 2.3.1 CAT基因在纺织方面的应用
• 2.3.2 CAT基因在食品方面的应用
• 3 本研究的意义
• 第二章 褶纹冠蚌过氧化氢酶基因的克隆、原核表达及酶活性分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂
• 2.3 试验材料
• 2.4 试验方法
• 2.4.1 血细胞总RNA的提取
• 2.4.2 褶纹冠蚌SMART cDNA的合成
• 2.4.3 cpCAT cDNA中间序列的扩增
• 2.4.4 cpCAT基因5’末端和3’末端cDNA扩增
• 2.4.5 cpCAT基因组克隆
• 2.4.6 测序和序列分析
• 2.4.7 半定量PCR检测cpCAT的组织表达特征
• 2.4.8 cpCAT基因全长原核表达及重组表达质粒的构建
• 2.4.9 重组cpCAT的诱导表达及纯化
• 2.4.10 CAT重组cpCAT可溶蛋白浓度及活性测定
• 2.4.11 温度,PH及变性剂对重组cpCAT活性的影响
• 3 结果
• 3.1 褶纹冠蚌血液中总RNA的纯度
• 3.2 褶纹冠蚌CAT基因的cDNA序列
• 3.3 cpCAT基因的cDNA全长分析及序列鉴定
• 3.4 推导的cpCAT氨基酸序列的同源性比较
• 3.5 基于推导的cpCAT氨基酸序列建立的进化树分析
• 3.6 cpCAT的基因结构
• 3.7 cpCAT的组织表达特征
• 3）中的表达'>3.8 cpCAT重组质粒的构建及在大肠杆菌（DE₃）中的表达
• 3.9 cpCAT可溶蛋白诱导表达及纯化
• 3.10 可溶蛋白浓度及活性测定
• 3.11 温度,PH及变性剂对重组cpCAT活性的影响
• 4.讨论
• 第三章 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果