p120ctn对Kaiso的调控及两者在肺癌中作用的研究

论文摘要

作为Armadillo蛋白亚家族中的重要成员之一的p120-catenin（p120ctn）一直被认为是E-cadherin/catenin黏附复合物的重要调节因子。同时,p120ctn也是小GTP酶的重要调节因子,它可以在细胞浆中通过调节小GTP酶的活性状态来调控细胞骨架的装配,它在细胞黏附以及肿瘤侵袭和转移方面的作用已经受到人们的广泛重视。大量研究表明,p120ctn的异常表达与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。随着研究的深入,特别是核转录因子Kaiso的发现,人们发现p120ctn还可以作为一种信号分子穿梭于核/浆之间,通过影响核转录因子Kaiso调控基因表达。Kaiso是BTB/POZ蛋白家族的重要成员,其氨基端有一个POZ/BTB结构域,羧基端有三个C-2H-2锌指结构。氨基端POZ/BTB结构域的功能是:（一）Kaiso分子之间形成同二聚体;（二）与其他蛋白分子（如CTCF、HDAC等）形成异二聚体。羧基端锌指结构的功能是:（一）与一些肿瘤相关基因的启动子区域（如matrilsin、CDKN2A等）结合,抑制这些基因的表达;（二）与p120ctn结合。p120ctn是Kaiso最重要的结合蛋白,在特定条件下,它能够阻断Kaiso对下游基因的抑制,从而调控这些基因的表达。Kaiso在肿瘤中发挥的作用还很不清楚。不同研究小组得出的结论甚至严重冲突,有研究认为Kaiso可能是一个抑癌因子,还有研究则得出了完全相反的结论。故Kaiso是促癌因子还是抑癌因子目前还没有定论,有待进一步阐明。与p120ctn类似,转录因子Kaiso也能够在核/浆之间穿梭,但它在细胞核、细胞浆中是否都发挥着同样的功能还有待研究。此外,Kaiso核浆穿梭的调控机制还不是十分清楚。有研究表明肿瘤微环境影响了Kaiso的核浆分布,而p120ctn并不参与Kaiso的核浆穿梭过程;而另有研究却给出了相反的实验证据,即p120ctn在细胞浆中过表达后,Kaiso也与p120ctn共定位于细胞浆。因此,p120ctn究竟能否调控Kaiso的核浆穿梭还有待进一步研究。曾有学者利用免疫组织化学的方法检测了多种人类良恶性组织（均为小样本）中Kaiso的表达情况,结果发现:Kaiso在多种实体恶性肿瘤中以细胞浆为主,而在体外培养的多种细胞系（如MDCK、NIH3T3、HT29、SW48细胞等）,Kaiso以细胞核表达为主。由于即使是处于进展期的肿瘤组织,也只是少数细胞处于增殖阶段（S期+G2期）,肿瘤体积的增大是由于肿瘤细胞凋亡减少造成的,而体外培养的细胞在一段时间内会有大量的细胞处于增殖期。因此,我们推测Kaiso在核或浆的分布,很有可能还与细胞周期有关。当细胞处于增殖阶段时,Kaiso入核。本研究目的旨在探讨肺癌组织中p120ctn和Kaiso的表达情况及与临床病理学参数意义、肺癌患者预后的关系。在细胞水平上,应用shRNA干扰技术研究Kaiso的核内功能,通过稳定干扰和过表达p120ctn的表达,分析p120ctn亚型蛋白1和3对Kaiso表达和定位的影响。运用细胞周期同步化技术探讨细胞周期对Kaiso核浆分布的影响。方法1、肺癌组织原发性肺癌标本及配对的淋巴结转移癌均来自中国医科大学第一附属医院外科1998-2005年手术切除的标本。所有患者术前均未接受放、化疗。其中部分患者保存有完整、详实的预后资料。标本经4%中性甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色后明确诊断。其中部分癌旁肺组织（远离肿瘤至少5厘米）和淋巴结转移癌离体后立即放入液氮后-70℃冰箱保存备用。2、免疫组织化学染色及结果判定标本用中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4μm切片,经脱蜡,脱苯,水化后,采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测Kaiso和p120ctn蛋白表达。单克隆抗体Kaiso和p120ctn 4℃孵育过夜。以癌旁肺支气管粘膜上皮细胞着色强度和定位为内对照,PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定:高倍视野（×400）下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数,按Kaiso表达百分率分为以下四个等级:<25%为0分,26%-50%为1分,51%-75%为2分,>75%为3分。根据免疫组化染色强度分为三个等级:浅黄色计为1分,棕黄色计为2分,黄褐色计为3分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分,积分为0和1分者判定为阴性,积分≥2为阳性。当Kaiso核阳性信号≥5%时定为核阳性表达。p120ctn正常表达的阳性信号定位于细胞膜,表现为膜着色清楚、连续且阳性细胞数≥90%;膜表达下降表现为膜着色淡且不连续,阳性细胞数<90%;而超过10%的肿瘤细胞胞浆出现阳性信号定为异位表达。p120ctn的异位表达和膜表达下降统归为p120ctn异常表达。3、间接免疫荧光检测固定后的冰冻组织切片和细胞爬片用0.2%Triton X-100处理15分钟,非免疫动物血清封闭,一抗为单克隆抗体小鼠抗人Kaiso和小鼠抗人p120ctn 4℃孵育过夜;二抗为异硫氰酸荧光素（FITC）标记或罗丹明标记（TRITC）标记的山羊抗小鼠IgG,碘化丙啶或DAPI进行核复染。50%缓冲甘油封片,荧光显微镜Olympus IX51于波长为527nm处观察罗丹明荧光强度,于372nm波长处观察DAPI的荧光染色观察并照相。阴性对照实验:用等量的0.01mol/LPBS代替一抗。4、Western BlOt将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,单克隆抗体Kaiso或p120ctn4C孵育过夜,辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2小时后DAB或ECL显色。5、RT-PCR采用TrizolTM试剂提取肺癌组织或培养细胞的总RNA,利用RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒进行反转录。分别扩增Kaiso、p120ctn和matrilysin,以β-actin为内参。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,成像分析。6、细胞培养在37℃,含5%CO2的培养箱内培养人类肺癌细胞系BE1、SPC-A-1、LTEP-A-2和A549细胞系,培养基分别为含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640或高糖DMEM,贴壁生长,每2-3天胰酶消化传代一次。7、质粒构建与转染shRNA干扰质粒导入感受态宿主细菌E.coli中扩增、纯化,使用Arrest-InTMTransfection Reagent转染试剂将质粒分别转染至肺癌细胞系LTEP-A-2、SPC-A-1和BE1中,通过Western Blot和RT-PCR鉴定转染效果。将含有目的基因的载体导入感受态宿主细菌DH5a中扩增、纯化,测序验证后,使用Lipofect 2000转染试剂将质粒分别转染至肺癌细胞系A549中,并以G418筛选出阳性细胞克隆,通过Western Blot和RT-PCR鉴定转染效果后,挑取转染成功的单克隆细胞在含有G418的RPMI 1640或高糖DMEM培养液中继续培养。8、体外基质胶侵袭实验检测细胞侵袭能力按照BD公司说明操作,取100μl细胞悬液（5×106个/m1）滴入上室内,下室加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,上下室之间用孔径为8μm的聚碳酸酯微孔滤膜分开,将小室置37℃,5%CO2条件下放置后,弃去上室内液体,擦尽膜上Matrigel胶,100%甲醇固定30分钟,常规苏木素染色,光镜下计数细胞数。9、四甲基偶氮唑盐（tetrazolium,MTT）法检测细胞增殖能力取对数生长期的肺癌细胞悬液（细胞密度3×105个/ml）分别接种于4个96孔板培养板,每板分6组:空白组（A）（B）,干扰对照组（C）、干扰组（D）、抗体抑制对照组（E）和抗体移植组（F）。培养第24、48、72小时分别加入MTT（5mg/m1）20μl,继续孵育4小时后,每孔加入150μlDMSO溶解结晶,选择波长490nm,在酶联免疫（ELISA）检测仪上测定各孑L吸光度。实验重复3次。绘制细胞生长曲线。10、核浆蛋白分离按照Thermo公司说明操作,取一定体积（100mg）的组织或者10×106。的细胞,依次加入体积比为200:11:100的试剂CERⅠ,CERⅡ和NER,分别提取细胞浆蛋白和细胞核蛋白。检测a-tubulin和Lamin B 1在两种细胞组分中的表达以验证核浆蛋白分离效果。11、免疫共沉淀提取的蛋白中加入4μg的诱饵蛋白抗体,充分混匀后4℃孵育2小时后加入25μl Protein G Microbeads,混匀后继续4℃孵育1小时。按照操作说明步骤,混合液过μ柱,SDS上样缓冲液冲洗μ柱,收集免疫共沉淀产物。12、细胞周期同步化GO期同步化（血清饥饿法）:指数生长期的肺癌细胞,培养至汇合密度为30%时收集细胞,1000rpm离心5分钟,PBS洗2次后铺板接种,换成无血清的RPMI-1640/DMEM培养液,继续培养36小时后用于检测。S期同步化（胸苷双阻断法）:指数生长期的肺癌细胞,培养液中加入胸苷至终浓度2mmol/L,继续培养18小时。以1000rpm离心5小时,弃上清,用PBS清洗3次,去除胸苷阻滞。将细胞重新悬浮成细胞悬液,接种到培养瓶中继续培养16小时。培养液中再加入胸苷,使之终浓度为2mmol/L,继续培养12小时。用0.25%胰蛋白酶溶液消化后,换新鲜培养液,1000rpm离心,预热Hanks液清洗2次后接种入另一培养瓶内,继续培养2小时后用于检测。13、流式细胞仪检测细胞周期收集对数生长期细胞制成1×107个/ml细胞悬液。取1ml细胞悬液75%冷乙醇于4℃固定、离心后制成500μl的细胞悬液,加碘化丙啶染液于4℃孵育45分钟后上机检测,ModFitLT3.O软件分析细胞周期。14、统计分析各组资料利用SPSS for Window 13.0进行统计分析。p<0.05有统计学意义。结果1、Kaiso主要表达于肺癌组织细胞浆内并与肺癌患者不良预后相关Kaiso在癌旁肺支气管上皮细胞中存在微量的浆表达,但按照我们制定的阳性标准判定为阴性表达。294例肺癌组织标本中Kaiso蛋白浆阳性表达187例,占63.61%,明显高于癌旁支气管上皮Kaiso的表达水平（p<0.005）。Western blot检测结果证实,肺癌组织中Kaiso蛋白的表达量要显著高于原发灶中Kaiso蛋白的表达量（t=10.610,n=20,p=0.000）。Kaiso浆阳性表达与TNM分期和淋巴结转移密切相关（均p<0.05）,与肺癌患者的性别、年龄、分化程度、组织学类型均无明显相关性。III+IV期Kaiso浆阳性表达率（70.42%）显著高于I+II期（57.24%）（ρ=0.019）,有淋巴结转移的肺癌病例Kaiso浆阳性表达率（71.2%,116/163）显著高于没有淋巴结转移的肺癌病例（28.8%,47/131）（ρ=0.003）;原发灶和淋巴结转移癌的配对标本中,淋巴结转移癌中Kaiso的浆阳性率（90.9%）显著高于原发灶的Kaiso浆阳性率（72.7%）（ρ=0.001）。单因素分析结果显示,Kaiso蛋白浆表达与肺癌患者的不良预后密切相关（ρ=0.002）。Cox模型多因素分析结果显示Kaiso浆表达可能是影响肺癌患者预后的独立危险因素（ρ=0.054）。2、Kaiso浆表达与p120ctn的浆表达具有较好的协同性,两种蛋白在肺癌组织处于结合状态统计学分析表明,196例肺癌组织的原发灶中,Kaiso浆表达与p120ctn的浆表达存在显著的相关性（Kappa=0.269,ρ=0.000）。55例肺癌配对标本的原发灶和转移灶中,Kaiso与p120ctn的浆表达也存在显著相关性（Kappa=0.267,ρ=0.037）（Kappa=0.393,ρ=0.001）。免疫共沉淀检测了13例肺癌原发灶和淋巴结转移癌中Kaiso和p120ctn的结合情况（免疫组化检测表明,这13例组织的原发灶和转移灶中Kaiso和p120ctn均阳性表达）,结果表明,无论原发灶还是转移灶,均能够检测到Kaiso-p120ctn复合物。3、干扰肺癌细胞Kaiso核表达后,肺癌细胞的增殖和侵袭能力显著增强,核内基因matrilysin转录水平显著上调转染shRNA-Kaiso质粒下调Kaiso的核表达或加抗体抑制Kaiso的核内功能后,受Kaiso抑制的基因matrilysin转录水平上调,证实Kaiso核内功能被取消,丧失了对下游靶基因的抑制作用。MTT法和基质胶侵袭实验结果显示,丧失Kaiso核内功能后,肺癌细胞的增殖能力和侵袭能力均显著增强。4、Kaiso的蛋白表达量和核浆分布受p120ctn的调控,p120ctn 3A直接与Kaiso结合,而p120ctn 1A并不与Kaiso直接结合将p120ctn高表达的肺癌细胞系BE1和p120ctn中等量表达的SPC-A-1细胞中的p120ctn稳定干扰后发现,虽然Kaiso的mRNA表达水平没有发生显著变化,但是Kaiso蛋白表达量显著下调。尤其引人关注的是,Kaiso的核浆分布发生了显著变化:稳定干扰p120ctn表达后,分布于细胞核的Kaiso明显减少,甚至消失,分布于细胞浆（尤其是核膜周区域）中的Kaiso增加。与之相反,SPC-A-1细胞在稳定干扰了p120ctn的表达后,细胞核内的Kaiso增加,细胞浆中的Kaiso明显减少以p120ctn低表达的肺癌细胞系A549为基础,分别建立稳定过表达p120ctn亚型1A和3A的细胞系。RT-PCR检测结果表明,稳定过表达p120ctn亚型1A和3A均不影响Kaiso的mRNA表达,但都明显上调了Kaiso蛋白的表达量。p120ctn亚型1A和3A过表达均能影响Kaiso的核浆分布,但又存在差别:虽然p120ctn亚型1A和3A过表达均能够增加Kaiso在细胞浆和细胞核中的表达,但p120ctn亚型3A促进Kaiso核定位的能力要强于p120ctn亚型1A。免疫共沉淀结果显示,Kaiso只能与p120ctn亚型3直接结合,而并不与p120ctn亚型1直接结合。5、Kaiso的核浆分布可能还与细胞周期有关在体外培养的条件下,不同培养时间点Kaiso的核浆分布存在差异。应用细胞周期同步化的方法,把BE1和siRNA-BE1细胞同步化至GO期和S期后发现,Kaiso在GO期更多见于细胞浆,而在S期则更多见于细胞核。结论1、Kaiso在细胞浆和细胞核中的生物学作用不同。肺癌组织中Kaiso的表达量明显高于癌旁肺组织,Kaiso的浆阳性表达与肺癌的分期、淋巴结转移、不良预后密切相关,可能是影响肺癌不良预后的独立危险因素。Kaiso在细胞核内抑制着matrilysin基因的转录,下调Kaiso的核表达使肺癌的增殖和侵袭能力显著上调。2、p120ctn和Kaiso在肺癌中协同表达,p120ctn调控着Kaiso的蛋白表达量和核浆分布。p120ctn与Kaiso在肺癌组织中协同浆表达,在肺癌原发灶及淋巴结转移癌中均能检测到Kaiso-p120ctn复合物。p120ctn亚型1和亚型3都可以影响Kaiso的蛋白表达量,但不影响Kaiso的转录水平。p120ctn亚型1和亚型3都能增加Kaiso的核、浆表达,但p120ctn亚型3对Kaiso核浆分布的调控能力要强于p120ctn亚型1。p120ctn亚型3很可能通过与Kaiso直接结合的方式调控Kaiso的表达和核浆分布,而p120ctn亚型1并不是通过直接结合的方式。3、Kaiso的核浆分布可能还受到细胞周期的影响,但具体机制有待深入探讨。

论文目录

• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 英文缩略语
• 论文一 肺癌中Kaiso 的浆表达与肺癌的不良预后相关
• 前言
• 实验材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文二 Kaiso 表达和定位受p120ctn、细胞周期影响
• 前言
• 实验材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介