大豆磷脂对凋亡相关基因及抗氧化能力的影响

论文摘要

磷脂是一种纯天然的营养保健品,主要存在于动、植物的细胞中,是细胞膜的主要组成成分。大豆磷脂可以维持生物膜正常的结构与功能,与细胞的生长、增殖、分化、癌变紧密联系,其降解产物还参与细胞的信号转导、代谢调控,具有改善记忆、延缓衰老、调节血脂、抗肿瘤、健脑等多种生理作用。因此本实验研究大豆磷脂对学习记忆相关基因及抗氧化能力的影响,并探讨其作用机制,为大豆磷脂更好的应用提供实验依据,进而对神经细胞的保护作用等方面提供新的思路。实验方法：1.建立D-半乳糖致衰大鼠模型,将50只SD雄性大鼠按体重随机均分成5组,即正常对照组、模型对照组、大豆磷脂低剂量组（0.5 g/kg/d）、中剂量组（1.0g/kg/d）、高剂量组（1.5 g/kg/d）。模型对照组、大豆磷脂组皮下注射D-半乳糖50 mg/kg/d,正常对照组注射等量生理盐水。每天定时灌胃和注射各1次。第30 d测学习记忆,第45 d处死大鼠,取各组织分别测定MDA含量、SOD和CAT活力。2.建立D-半乳糖致衰大鼠模型,第45 d处死大鼠,提取海马和大脑皮层中总RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,定量检测其海马和皮层中Bax、p53、Bcl-2、c-fos、NCAM的基因表达。3.体外培养神经细胞。取出生24 h内小鼠,75%酒精消毒,取大脑,剔除脑膜和血管,剪成1mm3小块,0.125%胰蛋白酶37℃消化20 min,终止消化后1000r/min离心5 min,取沉淀,制成细胞悬液,细胞计数并调整密度至2×106个/mL,接种入经0.1% L-多聚赖氨酸包被过的培养板内,置37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。24 h后全量换液,接种3d后,再次全量换液,加入含不同浓度大豆磷脂的完全培养液,继续培养。细胞培养6d后即做下一步实验。MTT法和台盼蓝法检测细胞活力,收集细胞,分别测定蛋白质总含量、MDA含量和CAT活性。4.体外培养神经细胞。在倒置显微镜下观察不同时期神经细胞的形态变化,细胞培养6d后,通过AO/EB荧光染色、Hoechst 33258荧光染色、单细胞凝胶电泳观察细胞结构,扫描电镜观察细胞表面超微结构。实验结果：1.与正常对照组相比,致衰大鼠学习记忆能力显著下降（P<0.05）,各组织中MDA含量显著增加,SOD.CAT活性明显减弱（P<0.05）；与模型对照组相比,大豆磷脂组的大鼠学习记忆能力明显提高（P<0.05）,各组织中MDA含量显著减少,SOD、CAT活性显著增强（P<0.05）,表明本实验已成功建立D-半乳糖致衰模型,且大豆磷脂具有增强学习记忆力和提高抗氧化能力。2.与正常对照组相比,模型对照组Bax/β-actin与p53/β-actin的比值均增大,差异极显著（P<0.01）；Bcl-2/β-actin与NCAM/β-actin的比值均减小,差异极显著（P<0.01）；c-fos/β-actin的比值增大无显著性（P>0.05）。与模型对照组相比,大豆磷脂组Bax/β-actin的比值显著减小（P<0.05）；p53/β-actin的比值有减小的趋势（P>0.05）；Bcl-2/β-actin与NCAM/β-actin的比值均增大,差异极明显（P<0.01）；c-fos/β-actin的比值极显著减小（P<0.01）。实验表明,大豆磷脂可以降低致衰大鼠海马和皮层组织中Bax、p53、c-fos基因表达,提高Bcl-2、NCAM基因表达。3.MTT染色法结果显示,与正常对照组相比,大豆磷脂10-7mg/mL—10-5mg/mL组神经细胞活力增强,并且随着大豆磷脂浓度的增大,神经细胞活力逐渐增强,大豆磷脂10-5mg/mL组与正常对照组之间差异显著（P<0.05）,但是大豆磷脂10-5mg/mL—10-3mg/mL组中神经细胞活力减弱,且大豆磷脂10-3mg/mL组的细胞活力略低于正常对照组,说明大豆磷脂的浓度并不是越高越好,而是应该控制在一定的浓度范围内。台盼蓝染色结果显示各组之间神经细胞存活率差异不显著（P>0.05）。神经细胞中蛋白质总含量和MDA含量均无明显差异（P>0.05）,CAT活性有增强的趋势（P>0.05）。实验表明,大豆磷脂对神经细胞的抗氧化能力有一定的促进作用。4.倒置显微镜下,细胞接种4h开始贴壁,分布均匀,细胞圆并透明；培养24 h后,细胞绝大部分呈梭形,细胞呈立体隆起状,表面光滑,细胞有单极突起出现,少数细胞还有双极突起出现；培养3d后,细胞主要呈梭形形态,且胞体饱满,细胞突起增多、增长,双极和多极突起明显增多,光晕明显,细胞之间开始形成完整的神经网络结构；培养6d后,细胞呈梭形、三角形等多种形态,胞体明显增大,突起增粗,增长,突起数量增多。经AO/EB荧光染色后,正常对照组与大豆磷脂组均呈现荧光深浅不一的结构样特征,核染色质着绿色且细胞形态结构正常。Hoechst 33258染色结果显示,正常对照组和大豆磷脂组细胞核形态均规则,呈现均一的弱蓝色荧光,结构正常。单细胞凝胶电泳中,正常对照组与大豆磷脂组均没有出现拖尾现象。且Hoechst33258染色和单细胞凝胶电泳结果均显示大豆磷脂能增加神经细胞密度。扫描电镜中,大豆磷脂组神经细胞表面皱褶丰富,突起数量多,双极或者多极分化清楚,相互间呈网状。实验表明,一定浓度的大豆磷脂可以维持神经细胞的正常结构,提高神经细胞的密度,且有促进神经细胞突起分化、增长的功能。结论：1.大豆磷脂具有增强记忆和延缓衰老的作用,可以缓解或部分缓解由D-半乳糖对大鼠的致衰作用。2.大豆磷脂通过下调表达Bax、c-fos、p53和上调表达Bcl-2、NCAM,延缓机体衰老,从而达到改善D-半乳糖致衰大鼠学习记忆能力。3.在一定的浓度范围内,大豆磷脂具有提高大脑神经细胞活力,提高大脑神经细胞抗氧化能力的功效,使得机体内有效的自由基清除系统可以维持体内自由基的正常水平。4.大豆磷脂具有促进神经细胞生长,维持神经细胞正常结构等功效。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 符号说明
• 第一章 综述
• 1 大豆磷脂
• 1.1 大豆磷脂的化学结构
• 1.2 大豆磷脂的理化性质
• 1.3 大豆磷脂的生理活性
• 1.3.1 调整机体膜功能
• 1.3.2 促进神经传导,增强大脑功能
• 1.3.3 提高学习记忆能力
• 1.3.4 可以调节血脂,防治肝功能障碍
• 1.3.5 对衰老疾病的修复治疗
• 1.3.6 大脑中磷脂比例的变化与某些疾病相关联
• 1.3.7 其他功能
• 2 大豆磷脂与学习记忆力
• 2.1 大豆磷脂促进神经传导,增强学习记忆力
• 2.2 大豆磷脂改善脑中脂肪酸的成分,增强学习记忆力
• 2.3 大豆磷脂提高脑中蛋白质含量,增强学习记忆力
• 2.4 大豆磷脂改善脑组织的磷脂成分,增强学习记忆力
• 2.5 大豆磷脂改善血液循环,增强学习记忆力
• 2.6 大豆磷脂提高脑内抗氧化能力,增强学习记忆力
• 3 凋亡基因
• 3.1 Bax与Bcl-2基因
• 3.2 p53基因
• 3.3 c-fos基因
• 3.4 NCAM基因
• 4 氧化应激
• 4.1 氧化应激的概念
• 4.2 氧化应激与衰老
• 4.3 自由基生物抗氧化与疾病
• 5 课题研究的意义
• 第二章 大豆磷脂对致衰大鼠学习记忆及抗氧化能力的影响
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 供试品
• 2.2 实验动物
• 2.3 试剂与仪器
• 2.3.1 试剂
• 2.3.2 仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 试剂配制
• 2.4.2 实验动物分组及处理
• 2.4.3 开场行为
• 2.4.4 "Y"型迷宫测定学习记忆
• 2.4.5 大鼠处死,各组织的分离和保存
• 2.4.6 匀浆的制备
• 2.4.7 MDA-TBA比色法测定MDA含量
• 2.4.8 连苯三酚自养化法测定SOD活性
• 2.4.9 过氧化氢酶（CAT）活力测定
• 2.5 数据处理及统计分析
• 3 结果
• 3.1 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠开场行为的影响
• 3.2 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠学习记忆的影响
• 3.3 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠MDA含量的影响
• 3.4 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠SOD活性的影响
• 3.5 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠CAT活性的影响
• 4 讨论
• 第三章 大豆磷脂对致衰大鼠学习记忆相关基因表达的影响
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 供试品
• 2.2 实验动物
• 2.3 试剂与仪器
• 2.3.1 试剂
• 2.3.2 仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 实验动物分组及处理
• 2.4.2 大鼠处死,各组织的分离和保存
• 2.4.3 总RNA提取
• 2.4.4 引物设计
• 2.4.5 逆转录聚合酶链式反应
• 2.4.6 PCR产物定量
• 2.5 数据处理及统计分析
• 3 结果
• 3.1 总RNA的鉴定
• 3.2 实验样品的检测结果
• 3.3 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠Bax基因表达的影响
• 3.4 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠p53基因表达的影响
• 3.5 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠c-fos基因表达的影响
• 3.6 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠Bcl-2基因表达的影响
• 3.7 大豆磷脂对D-半乳糖致衰大鼠NCAM基因表达的影响
• 4 讨论
• 第四章 大豆磷脂对体外培养神经细胞活力及抗氧化能力影响
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 供试品
• 2.2 实验动物
• 2.3 试剂与仪器
• 2.3.1 试剂
• 2.3.2 仪器
• 2.4 试剂配制
• 2.5 大脑神经细胞的原代培养
• 2.5.1 包被细胞培养板
• 2.5.2 大脑神经细胞培养
• 2.6 MTT法测定神经细胞活力
• 2.7 台盼蓝染色法测定神经细胞存活率
• 2.8 总蛋白质含量测定
• 2.9 MDA-TBA比色法测定MDA含量
• 2.10 过氧化氢酶（CAT）活力测定
• 2.11 数据处理及统计分析
• 3 结果
• 3.1 大豆磷脂对大脑神经细胞活力的影响
• 3.2 大豆磷脂对大脑神经细胞存活率的影响
• 3.3 大豆磷脂对大脑神经细胞中总蛋白质含量的影响
• 3.4 大豆磷脂对大脑神经细胞中MDA含量的影响
• 3.5 大豆磷脂对大脑神经细胞中CAT活性的影响
• 4 讨论
• 第五章 大豆磷脂对体外培养神经细胞结构的影响
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 供试品
• 2.2 实验动物
• 2.3 试剂与仪器
• 2.3.1 试剂
• 2.3.2 仪器
• 2.4 试剂配制
• 2.5 大脑神经细胞的原代培养
• 2.5.1 包被细胞培养板
• 2.5.2 大脑神经细胞培养
• 2.6 倒置显微镜观察
• 2.7 AO/EB荧光显微镜观察
• 2.8 Hoechst 33258荧光显微镜观察
• 2.9 单细胞凝胶电泳
• 2.10 扫描电镜观察
• 2.11 数据处理及统计分析
• 3 结果
• 3.1 大脑神经细胞形态学观察结果
• 3.2 AO/EB染色结果
• 3.3 Hoechst 33258染色结果
• 3.4 大豆磷脂对大脑神经细胞细胞核DNA的影响
• 3.5 大豆磷脂对大脑神经细胞表面超微结构的影响
• 4 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢