论文摘要
草菇(Volvariella volvacea)是一种高温型生长及储存的食用菌,具有较高的营养和保健价值,在我国已有悠久的栽培历史。同大多数热带和亚热带作物一样,草菇不耐低温冷藏,即使在常规低温4℃条件下,菌丝也会迅速自溶,子实体会软化、液化甚至腐烂,这一特性严重制约了草菇的生产和流通。目前对于草菇的低温自溶的根本原因和作用机制还难以阐释清楚。从分子水平探讨草菇低温自溶机理,并对其耐寒机制加以遗传改造,可以为实现草菇低温保鲜,低温栽培以及菌种低温保藏提供理论依据。上个世纪90年代发展起来的实时定量PCR技术,以其准确性,敏感性和高通量方面的优势已成为基因表达研究的主流技术之一。它通过加入荧光染料实时监测PCR过程中产物的积累,从而了解PCR产物动态增加的全过程。与以往的定量技术比较,它不仅操作简便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好,而且是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,扩增后直接获得结果,无须再进行后续操作,大大降低了污染的可能性。孙晓红等采用mRNA差异显示技术结合低温处理草菇cDNA文库的筛选,获得草菇低温应答基因cor1和cor4的序列片段,在此基础上,本项实验采用SYBRGreenⅠ嵌合荧光定量PCR对草菇冷诱导基因cor1和cor4在低温下的表达进行了研究。本实验将草菇菌株V23和经V23诱变的耐低温草菇菌株VH3的菌丝体在4℃下处理不同时间,分别提取菌丝体总RNA,以反转录获得的cDNA作为模板进行PCR扩增,构建含目的基因和gpd内标基因片段的质粒标准品,采用荧光定量PCR技术研究目的基因cor1和cor4在低温下的表达变化。实验结果表明,草菇V23菌株的cor1基因未经低温处理的表达量最大,低温处理后表达量持续下降,在6h达到最低值,8h和10h略有回升;而VH3菌株cor1基因低温处理后表达量明显增加,2h达到最大值,4h表达量下降,但6h表达量开始上升,10h表达量又下降,低温处理2h、6h、8h的表达量都高于未经低温处理的样品;V23菌株的cor4基因未经低温处理的表达量最大,低温处理后表达量持续下降,在6h达到最低值,8h该基因表达量上升;而VH3菌株中cor4基因低温处理后表达量明显增加,4h达到最大值,6h下降,8h到最低值,10h又上升,低温处理2h、4h的表达量高于未经低温处理的样品。通过推测cor1和cor4基因表达与草菇耐低温特性的相关性,希望为今后利用草菇自身的抗寒机制进行遗传改造提供理论依据。