LTA与LPS对血管内皮细胞的协同效应及其机制的研究

论文摘要

目的：通过培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）系,观察革兰氏阴性菌致病物质脂多糖（LPS）预处理后,对革兰氏阳性菌致病物质脂磷壁酸（LTA）刺激后血管内皮细胞（VEC）活化能力和损伤的影响,明确LPS是否对LTA引起的VEC活化及损伤具有增敏效应；若有增敏效应,其增敏效应是否通过胞膜TLR4介导的使TLR2上调所实现,借此研究肠源性细菌易位的革兰氏阳性菌感染的危重症患者其两类菌群之间是否具有协同效应并对其效应的机制进行初步探讨。方法：本实验共分为两个部分。第一部分以HUVEC系ECV304进行复苏和培养。首先以小剂量LPS孵育ECV3046h、8h、10h、12h、24h,用免疫细胞化学方法观察胞膜TLR2表达变化,选出TLR2表达量最多的“最佳刺激时间”。以前期实验结果为依据,分为三个处理组：对照组、内毒素组、TLR4抗体组,分别以空白培养液、小剂量LPS、LPS和TLR4抗体刺激细胞,采用MTT法检测三组细胞增殖活性变化；同时用实时定量PCR方法观察细胞内TLR2和TLR4mRNA的表达情况。第二部分以小剂量LPS或LPS+TLR4抗体对ECV304进行预处理后再用LTA刺激细胞,收集细胞上清液,应用酶联免疫方法（ELISA）检测上清液中白细胞介素-8（IL-8）、血管性血友病因子（vWF）的含量,借此观察小剂量LPS对VEC活化和损伤的影响以及TLR4在其中发挥的作用。结果：第一部分实验中未刺激的ECV304单层生长,呈鹅卵石状镶嵌排列,边界清楚；小剂量LPS刺激可引起细胞长宽比例增大,细胞梭形化,排列紊乱,边界不清,LPS持续刺激12h后细胞上述表现加重并逐渐出现个别细胞死亡,尤其刺激24h可发现有核碎裂、死亡、飘起的现象；用免疫细胞化学方法检测结果显示小剂量LPS可以上调ECV304细胞膜TLR2的表达,“最佳刺激时间”为8h；MTT法检测结果显示LPS刺激组和TLR4抗体组孵育8h对细胞的增殖活性无明显影响；实时定量PCR检测胞膜TLR2、TLR4mRNA表达结果显示：LPS刺激组孵育4h TLR2mRNA表达未见明显变化,8h时TLR2mRNA表达上调,TLR4抗体组8h TLR2mRNA表达水平仍明显升高,但与LPS刺激组比较TLR2mRNA表达无明显差异；LPS刺激组孵育4h、8h均可上调TLR4mRNA表达,TLR4抗体组TLR4mRNA表达也有明显升高,但与LPS刺激组比较孵育8h后TLR4mRNA表达较低。第二部分实验结果显示：LPS或LTA刺激ECV304,细胞培养上清液中vWF及IL-8的水平均有一定程度的升高；经小剂量LPS预处理8h后,再用LTA孵育细胞24h,上清液中vWF及IL-8的水平较LPS或LTA单一刺激有显著升高,加入抗体封闭胞膜TLR4未对vWF及IL-8的分泌水平产生影响。结论：小剂量LPS对LTA引起的VEC活化及损伤具有协同效应；其协同效应与TLR2上调有关,而TLR2的上调尚不能除外是由TLR4参与介导的；本研究发现TLR4抗体对LPS与LTA的协同效应无明显拮抗作用,其具体机制有待于进一步探讨。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 縮略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、小剂量LPS对血管内皮细胞TLR2、TLR4表达的影响
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 小剂量LPS对ECV304细胞生长形态的的影响
• 1.2.2 免疫细胞化学检测小剂量LPS对ECV304 TLR2表达的影响
• 1.2.3 MTT法检测小剂量LPS对ECV304细胞增殖活性的影响
• 1.2.4 实时定量PCR检测小剂量LPS对ECV304 TLR2、TLR4mRNA表达的影响
• 1.3 讨论
• 1.3.1 小剂量LPS致ECV304细胞形态学改变的影响
• 1.3.2 免疫细胞化学方法检测LPS刺激ECV304胞膜表面TLR2的变化
• 1.3.3 小剂量LPS对ECV304细胞增殖活性的影响
• 1.3.4 实时定量PCR检测LPS刺激ECV304细胞TLR2、TLR4 mRNA的变化
• 1.4 小结
• 二、LPS协同LTA对血管内皮细胞活化和损伤的影响
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 LPS预处理后LTA孵育对ECV304产生IL-8的影响
• 2.2.2 LPS预处理后LTA孵育对ECV304产生vWF的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 LPS对ECV304的作用
• 2.3.2 LPS与LTA对ECV304的协同作用
• 2.3.3 TLR4作用的初步探讨
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢