蜡样芽孢杆菌工程菌的构建及α-淀粉酶基因的表达

论文摘要

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是产生具有重要价值的耐高温α-淀粉酶（α-amylase）的优良菌株。通过对两株蜡样芽孢杆菌（B.cereus905和B.cereus904）分泌的α-淀粉酶酶学性质分析,淀粉酶的最适反应温度为90100℃,最佳pH范围为6.010.0,耐热性和酶活都不依赖Ca2+,酶学性质基本一致,但淀粉酶的分子量有明显的不同。PCR方法分别克隆了B.cereus905和B.cereus904耐高温α-淀粉酶的基因全长（amy905和amy904）,并在大肠杆菌中诱导表达,结果显示:amy905基因长度为1761bp,其蛋白分子量约为68 KD;amy904基因长度为1362bp,其蛋白分子量约为55 KD。大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pHP14-promp,内含一段来自B.cereus905基因组的启动子序列,将amy904基因插入该载体,获得了蜡样芽孢杆菌淀粉酶表达载体pHP14-amy904,用其转化蜡样芽孢杆菌B.cereus905,并成功在B.cereus905中表达。工程菌株遗传稳定性实验表明菌中质粒pHP14-amy904的稳定性为94%,生长曲线测定显示,野生菌株与工程菌株生长情况基本相同。本试验构建的工程菌,验证了载体pHP14-promp中来自B.cereus905基因组的启动子能在蜡样芽孢杆菌体内有效启动外源基因,并进行转录与表达。这一研究结果不仅为今后深入研究蜡样芽孢杆菌在定殖时外泌蛋白淀粉酶的作用机理打下了良好的基础,也为今后这些菌株进一步改造为更高效的抗病虫基因工程菌提供了一条可借鉴的思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物内生芽孢杆菌的研究进展
• 1.1.1 植物内生细菌的定义
• 1.1.2 内生芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用
• 1.1.3 植物内生芽孢杆菌的生物学作用及其机制
• 1.1.4 芽孢杆菌基因工程菌的研究进展
• 1.2 Α-淀粉酶研究进展
• 1.2.1 淀粉酶的概述
• 1.2.2 α-淀粉酶的概述
• 1.2.3 α-淀粉酶的性质
• 1.2.4 表达α-淀粉酶基因工程菌研究进展
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 B.CEREUS 905、904 淀粉酶酶学性质分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 缓冲液、药剂配制
• 2.1.4 α-淀粉酶酶活测定
• 2.1.5 Native-PAGE 测定
• 2.1.6 淀粉酶酶学性质测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 两种菌株的淀粉酶检测
• 2.2.2 pH 值对酶活力和稳定性的影响
• 2.2.3 温度对酶活力和稳定性的影响
• 2.2.4 金属离子和蛋白酶抑制剂对酶活力的影响
• 2.3 小结
• 3 Α-淀粉酶表达载体的构建及其原核表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细菌菌株和质粒
• 3.1.2 缓冲液、药剂配制
• 3.1.3 芽孢杆菌基因组 DNA 提取—基因组 DNA 的小量提取
• 3.1.4 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 3.1.5 PCR 扩增
• 3.1.6 DNA 片断的回收
• 3.1.7 DNA 的限制性酶切反应及连接反应
• 3.1.8 热激转化 E.coli 感受态细胞
• 3.1.9 碱裂解法提取质粒 DNA
• 3.1.10 DNA 基因序列的测定
• 3.1.11 样品的制备
• 3.1.12 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 目的 DNA 的制备
• 3.2.2 PCR 扩增
• 3.2.3 启动子的序列测定及特征分析
• 3.2.4 表达载体的构建及其鉴定
• 3.2.5 amy904 和amy905 基因在E.coli BL21（DE3）的诱导表达
• 3.3 结论
• 4 Α-淀粉酶表达载体的构建及在蜡样芽孢杆菌中的表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 质粒向 B.cereus 的电击转化
• 4.1.2 工程菌株遗传稳定性测定
• 4.1.3 生长曲线绘制
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 PCR 引物的设计
• 4.2.2 载体pHP14-prom 介绍
• 4.2.3 表达载体启动子酶切验证与纯化
• 4.2.4 蜡样芽孢杆菌α-淀粉酶表达载体的构建
• 4.2.5 pHP14-amy904 载体的鉴定
• 4.2.6 蜡样芽孢杆菌的电击转化
• 4.2.7 amy904 基因的在蜡样芽孢杆菌中表达
• 4.2.8 质粒遗传稳定性测定
• 4.2.9 基因工程菌株与野生菌株生长曲线的测定
• 4.3 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介