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甘蓝型油菜、白菜、甘蓝DFR基因家族的重克隆和RNA干扰研究

2020-12-12阅读(625)

甘蓝型油菜、白菜、甘蓝DFR基因家族的重克隆和RNA干扰研究

论文摘要

类黄酮是积累在大多数植物种子的次生代谢产物,涉及植物的休眠及生存能力等生理功能。类黄酮不仅在花、果实、种子、叶子的着色中起作用,还在植物与微生物的信号传导,育性,抗菌剂,抗紫外辐射中起重要作用。拟南芥（Arabidopsis thaliana）等植物中种皮色素的主要成分是原花青素单体的聚合物,是由公共苯丙烷-类黄酮-原花青素途径合成的。拟南芥种皮透明是由于类黄酮合成途径中各种步骤的缺陷导致的,这使得分析单个类黄酮基因的作用变得可行。其中二十多个改变种皮颜色的功能位点已经被鉴定。二氢黄酮醇4-还原酶（Dihydroflavonol 4-reductase,DFR）是类黄酮合成途径中形成花青素与原花青素的一个关键酶。拟南芥中的单拷贝DFR基因被人工采用X-射线照射而失活后,变异植株由于种皮原花青素的合成受堵而表现出黄籽性状。对埃塞俄比亚芥黄籽与黑籽近等基因系的比较研究表明,发育中的种子和幼苗叶片中色素的合成受控于DFR位点,黄籽中色素的缺乏主要是由于存在一个对温度敏感的DFR调节因子。通过对甘蓝型黄籽油菜与黑籽比较研究发现,黄籽中DFR基因的表达和酶活性严重减少,种皮PA合成强度比其他部分大幅减弱,认为黄籽品系的PA代谢途径中DFR基因的低水平表达是黄籽性状形成的重要原因。芸薹科（旧称十字花科）植物甘蓝型油菜（Brassica napus）、白菜（B. rapa）、甘蓝（B. oleracea）与拟南芥为同一个科,含有重要的蔬菜、油料、观赏、饲料、染料和药材等作物。黄籽油菜因其含油量高,种皮薄,质量好而成为一个颇受渴望的材料,其饼粕因纤维含量低,代谢能量高成为很好的动物饲料。因此,克隆芸薹属DFR基因和验证其功能是揭示芸薹属植物种皮发育、种皮色素积累机理的重要内容,并为油菜黄籽性状分子的育种奠定了基础。本研究补充克隆了白菜,甘蓝,甘蓝型油菜的DFR基因家族的基因组序列,并对其进行了的生物信息学分析,确定了三物种中DFR成员的数目。构建了它们的RNA干扰载体和正义表达载体,RNA干扰载体转化了甘蓝型油菜黑籽品种中双10号并获得一批转基因苗,调查了抑制DFR表达后农艺性状及生化成分的变化,采用半定量RT-PCR检测了DFR基因家族RNA干扰后花和花后20天种子中DFR总体及各个成员的表达情况,主要研究结果如下：1.重新克隆和鉴定了白菜、甘蓝、甘蓝型油菜DFR基因家族基于此前的研究和电子克隆,我们设计了3对引物,用这三对引物用梯度PCR分别扩增黑籽白菜、油菜和甘蓝型油菜的基因组DNA,最高退火温度回收,然后再用两对特异引物进行检测。从黑籽白菜基因组DNA中扩增出BrDFR1和BrDFR2两条基因,BrDFR1基因全长为1781bp,BrDFR2基因全长为1806 bp。从黑籽甘蓝基因组DNA中扩增出BoDFR1、BoDFR22条基因和1条假基因BoDFRpse;BoDFR1基因全长为1794bp,BoDFR2基因全长为1814 bp,BoDFRpse为1920bp。从黑籽甘蓝型油菜基因组DNA中扩增出甘蓝型油菜BnDFR1、BnDFR22条基因和1条假基因BnDFRpse,BnDFR1基因全长为1794bp,BnDFR2基因全长为1781 bp,BnDFRpse为1920bp。2.白菜、甘蓝、甘蓝型油菜DFR基因家族的同源性与进化分析NCBI Blastn同源分析表明甘蓝型油菜DFR1全长基因组序列（BnDFR1）与甘蓝DFR1全长基因组序列（BoDFR1）有着最高的同源性,甘蓝型油菜DFR2全长基因组序列（BnDFR2）与白菜DFR1全长基因组序列（BrDFR1）有着最高的同源性,甘蓝BoDFRpse基因与甘蓝型油菜BnDFRpse基因有最高的同源性。序列比对表明BnDFR1与BoDFR1;BnDFR2与BoDFR2;BnDFRpse与BoDFRpse之间在全长基因组水平的一致性分别为100%、100%、99.5%。这充分说明,异源四倍体甘蓝型油菜中的BnDFR1和BnDFRpse来自二倍体祖先物种甘蓝中的BoDFR1和BoDFRpse,BnDFR2分别来自二倍体祖先物种白菜中的BrDFR1。DFR基因位点的证据支持甘蓝型油菜是白菜和甘蓝的3倍化物种,这些证据也表明芸薹属祖先中DFR位点“三倍化”加倍后发生了成员丢失和假基因化,导致现在的二倍体物种中只有一条功能性的DFR基因,异源四倍体物种中只有2条功能性DFR基因。二倍体的甘蓝与白菜中的DFR位点是杂合的,似乎是出于功能强化或多样化的需要。3.构建了芸薹属DFR基因家族RNAi载体和4个正义表达载体克隆了600 bp的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段,利用NcoⅠ+AatⅡ双酶切将反义片段亚克隆到pFGC5941M的启动子与间隔区之间,利用BamHⅠ+XbaⅠ双酶切将正义片段亚克隆到pFGC5941M的间隔区与终止子之间,构建了11400bp的RNA干扰载体pFGC5941M-BDFRI。通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。利用克隆的芸薹属DFR基因家族4个成员的全长基因组序列,用BamHI+XbaI双酶切将BnDFR1/BoDFR1、BoDFR2、BnDFR2/BrDFR1、BrDFR2分别亚克隆到本课题组创建的平台载体pC2301M1BDP上,形成了植物正义表达载体pC2301M1BDP-BnDFR1/BoDFR1,pC2301M1BDP-BoDFR2, pC2301M1BDP-BnDFR2/BrDFR1,pC2301M1BDP-BrDFR2。4.RNAi转基因表明DFR是芸薹属的种皮色素性状的重要功能位点采用改良叶盘法,将RNA干扰载体pFGC5941M-BDFRI的工程菌株转化甘蓝型油菜的黑籽品种中双10号的下胚轴,获得了36株抗Basta的再生植株,经多重PCR检测表明其中至少有14株是转基因阳性植株。在转基因植株的生长发育过程中,系统地进行了性状观察,结果表明,RNA干扰抑制芸薹属DFR基因家族后,转基因甘蓝型油菜在茎叶色彩、生长发育、形态学等性状上与对照没有明显差异。收获的转基因种子与非转基因的阴性对照表明,转基因种子的颜色明显变浅,外观呈淡褐色和褐色,与对照的典型黑色对比明显。种子色度分析表明,转基因种子比非转基因种子的粒色R值平均升高了49.92%,种子千粒重略有下降。此研究表明,在甘蓝型油菜等芸薹属植物中,DFR基因家族主要参与种皮色素积累的过程。5.转基因植株花和花后20天种子中BnDFR基因家族的抑制程度提取了对照和10个转基因植株花和花后20天种子的RNA,用半定量RT-PCR的方法检测了DFR基因家族在非转基因阴性对照和转基因植株花和花后20天种子中的表达情况。与对照相比,BnDFR在RNA干扰后的转基因植株总体和单个成员表达的下调都较明显。不同转基因植株间BnDFR表达下调不同,说明了不同独立转化事件的转基因植株间在修饰效果上存在差异BnDFR及其成员在花后20天种子中的表达量要比花中的高,这与本课题组DFR在器官组织特异性的研究是一致的。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 甘蓝型油菜及其亲本物种的性状特征
  • 1.1.1 白菜型油菜的基本特征
  • 1.1.2 甘蓝的基本特征
  • 1.2 芸薹属的起源及其进化关系
  • 1.3 黄籽甘蓝型油菜的研究进展
  • 1.3.1 黄籽甘蓝型油菜的性状特征
  • 1.3.2 甘蓝型黄籽油菜种皮色泽的遗传学研究
  • 1.4 植物类黄酮生物合成途径的研究进展
  • 1.4.1 类黄酮类物质概述
  • 1.4.2 苯丙烷-类黄酮-花青素-原花青素的生物合成途径
  • 1.5 二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）及其研究进展
  • 1.5.1 DFR概述
  • 1.5.2 DFR基因的系统进化
  • 1.5.3 DFR的转基因与功能研究
  • 1.5.4 芸薹属花青素的研究
  • 第2章 引言
  • 第3章 材料与方法
  • 3.1 植物材料、载体和菌种
  • 3.1.1 植物材料
  • 3.1.2 菌种及质粒
  • 3.2 试剂和试剂盒
  • 3.2.1 核酸提取试剂及试剂盒
  • 3.2.2 基因克隆试剂及试剂盒
  • 3.2.3 半定量RT-PCR试剂盒
  • 3.3 主要仪器
  • 3.4 基因组总DNA的提取（CTAB法）
  • 3.5 目的片段的PCR扩增体系
  • 3.6 BnDFR、BrDFR、BoDFR家族的重克隆和鉴定
  • 3.6.1 BrDFR、BoDFR、BnDFR基因家族的电子克隆
  • 3.6.2 BrDFR、BoDFR、BnDFR基因家族的扩增
  • 3.6.3 琼脂糖凝胶电泳
  • 3.6.4 目的片段的回收
  • 3.6.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
  • 3.6.6 目的片段与pGEM-T easy载体的连接
  • 3.6.7 质粒DNA转化大肠杆菌
  • 3.6.8 转化子的蓝白菌落筛选及菌液PCR扩增鉴定
  • 3.6.9 BrDFR、BoDFR、BnDFR基因家族潜在成员的筛选
  • 3.6.10 测序和生物信息学分析
  • 3.7 芸薹属DFR基因家族RNA干扰载体的构建
  • 3.7.1 干扰片段的克隆
  • 3.7.2 质粒提取
  • 3.7.3 载体骨架的制备和反义片段的插入
  • 3.7.4 中间载体的酶切和正义片段的插入
  • 3.7.5 RNAi载体转化根癌农杆菌
  • 3.8 RNA干扰载体转化黑籽甘蓝型油菜
  • 3.9 从再生植株筛选鉴定转基因植株
  • 3.9.1 再生植株的Basta复检
  • 3.9.2 再生植株的PCR检测
  • 3.10 转基因植株中BnDFR基因家族被抑制程度的RT-PCR检测
  • 3.10.1 总RNA提取和纯化（试剂盒法）
  • 3.10.2 mRNA的反转录
  • 3.10.3 内标扩增
  • 3.10.4 转基因植株中BnDFR基因家族的半定量RT-PCR检测
  • 3.11 转基因植株的性状鉴定
  • 3.11.1 转基因植株的背景性状调查
  • 3.11.2 转基因植株的目标性状调查
  • 3.12 BoDFR、BrDFR和BnDFR基因家族正义载体的构建
  • 3.12.1 从克隆载体上切下并回收芸薹属DFR基因家族保守片段
  • 3.12.2 植物表达载体骨架的准备
  • 3.12.3 重组、转化大肠杆菌和鉴定
  • 3.12.4 正义载体转化根癌农杆菌
  • 第4章 结果与分析
  • 4.1 白菜、甘蓝、甘蓝型油菜基因组总DNA的提取
  • 4.2 BrDFR、BoDFR、BnDFR基因家族各成员gDNA的克隆
  • 4.2.1 BrDFR基因家族基因组序列的克隆
  • 4.2.2 BoDFR基因家族基因组序列的克隆
  • 4.2.3 BnDFR基因家族基因组序列的克隆
  • 4.3 BrDFR、BoDFR、BnDFR基因家族的核酸序列分析
  • 4.3.1 BrDFR、BoDFR、BnDFR基因家族的基因结构和核酸特征
  • 4.4 BrDFR、BoDFR、BnDFR基因家族的同源性和进化关系
  • 4.5 BrDFR、BoDFR、BnDFR基因家族编码蛋白的同源性
  • 4.5.1 芸薹属3个物种与拟南芥DFR蛋白同源性及系统进化分析
  • 4.5.2 BrDFR、BoDFR、BnDFR家族蛋白的亚细胞定位
  • 4.5.3 芸薹属DFR家族蛋白的二级结构预测
  • 4.6 BoDFR、BrDFR和BnDFR基因家族正义载体的构建
  • 4.6.1 从重组载体pMD19-T上切下DFR基因家族的正义片段
  • 4.6.2 植物表达载体pC2301M1BDP骨架的制备
  • 4.6.3 形成正义表达载体、转化和鉴定
  • 4.6.4 重组载体转化根癌农杆菌与鉴定
  • 4.7 DFR基因家族干扰载体的构建
  • 4.7.1 干扰片段的克隆
  • 4.7.2 反义片段的插入——中间载体的构建
  • 4.7.3 正义片段的插入——RNA干扰载体的获得
  • 4.7.4 转化农杆菌及菌株的PCR检测
  • 4.8 RNA干扰载体转化黑籽甘蓝型油菜的研究
  • 4.8.1 遗传转化
  • 4.8.2 再生植株的Basta抗性检测结果
  • 4.8.3 再生植株的PCR鉴定
  • 4.9 花和种子RNA的提取和cDNA的获得
  • 4.9.1 转基因油菜花和种子总RNA的提取
  • 4.9.2 转基因植株总cDNA的获得
  • 4.9.3 转基因植株花和花后20d种子中BnDFR家族表达的半定量RT-PCR
  • 4.10 转基因植株的性状调查
  • 第5章 讨论
  • 5.1 BoDFR、BrDFR和BnDFR基因家族的成员数与"三倍化"假说
  • 5.2 从DFR分析白菜、甘蓝与甘蓝型油菜的亲缘关系
  • 5.3 转基因抑制DFR表达是创造新型甘蓝型黄籽油菜材料的重要方法
  • 5.4 对甘蓝型油菜遗传转化体系的因素探讨
  • 第6章 结论
  • 6.1 重新克隆和鉴定了白菜、甘蓝、甘蓝型油菜DFR基因家族
  • 6.2 DFR基因位点证明了白菜、甘蓝与甘蓝型油菜的亲缘关系
  • 6.3 芸薹属DFR的进化关系和成员数
  • 6.4 构建了芸薹属DFR基因家族的正义载体
  • 6.5 构建了芸薹属DFR基因家族RNA干扰载体
  • 6.6 获得了RNAi转化后种皮色素减少的转基因甘蓝型油菜
  • 6.7 RNAi转化后抑制了甘蓝型油菜中DFR基因家族的表达
  • 参考文献
  • 缩略词
  • 致谢
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